II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Ngơ Đăng Nghĩa1, Nguyễn Thanh Sơn2 Nguyễn Anh Phương3, Lâm Thành Hưng
Ngày nhận bài: 05/6/2012; Ngày phản biện thơng qua: 13/6/2012; Ngày duyệt đăng: 12/9/2012
TĨM TẮT
Ốc cối thuộc họ ốc phân bố rộng ở vùng biển nhiệt đới. Trong cơng trình này, 3 lồi ốc cối Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum thu được từ ven biển Khánh Hịa được nghiên cứu dưới các khía cạnh: khối lượng các bộ phận của tuyến độc, thành phần conopeptid và thử nghiệm độc tính trên chuột. Kết quả cho thấy mỗi loại ốc cối cĩ lượng peptid khá lớn từ 50 đến trên 100 loại.
Từ khĩa: conopeptide, ốc cối, tuyến độc tố, sinh học thần kinh
ABSTRACT
Conus is the family distributed in the tropical marine areas. In this study, three species of Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum collected in the coastal area in the Khanh Hoa province were studied under different aspects that were the weigh of the venom system, quantity of conopeptides and toxic property in mouse. The results shown that every venom of species consited of from 50 to over 100 different peptides.
Keywords: conopeptide, conus, venom apparatus, neroscience
1 PGS.TS. Ngơ Đăng Nghĩa, 2CN. Nguyễn Thanh Sơn, 3CN. Nguyễn Anh Phương: Viện Cơng nghệ Sinh học & Mơi trường - Trường Đại học Nha Trang
24 TS. Lâm Thành Hưng: Laboratoire de Neurobiologie CNSR, Pháp
THÔNG BÁO KHOA HỌC
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ốc cối (Cone snails) là một nhĩm lớn, cho đến nay được ghi nhận khoảng 700 lồi, cĩ phân bố rộng, thuộc họ Conidae. Chúng săn mồi bằng một hệ thống nọc độc phát triển cao cĩ thể làm tê liệt con mồi trong vài giây, nhờ vậy đảm bảo sự bắt mồi và tránh để mồi lộ ra lâu cĩ thể bị các con cá lớn hơn giành mất. Mỗi lồi ốc cối sản sinh ra một loại độc tố riêng. Đĩ là một hỗn hợp của các peptid ngắn, cĩ liên kết disunfua, cĩ khả năng làm bất động con mồi rất nhanh. Độc tố này tùy thuộc vào loại mồi là cá (piscivorous species), nhuyễn thể (molluscivorous species) hay sâu (vermivorous species). (Richard J.Lewis 2009, Heinrich 2004)
Các peptid được chia thành 2 loại là conotoxin (gây tử vong) hoặc conopeptid ( khơng gây tử vong).
Mỗi loại độc tố ốc là một hỗn hợp chứa trên 100 loại peptide khác nhau. Khi giải mã gen, người ta thấy rằng các độc tố là các propeptid, sau đĩ chúng được enzym endoprotease phân cắt để tạo thành các peptid độc cuối cùng. Các peptid này cĩ kích thước nhỏ, tương đối dễ tổng hợp, cấu trúc ổn định, tác dụng vào các mục tiêu chuyên biệt làm cho chúng trở thành các đầu dị (probe) lý tưởng trong dược học. Một điều rất ngạc nhiên là đa số các độc tố ốc cĩ liên quan sự giảm đau đớn và được dùng trong trị liệu giảm đau. Người ta ước lượng cĩ khoảng trên 50.000 đến 100.000 loại conopeptide nhưng chỉ mới khoảng 0,1% được biết rõ về dược tính. Số độc tố lớn lao này là một nguồn vật liệu dồi dào cho việc nghiên cứu dược tính và ứng dụng. Các độc tố này tác dụng lên các kênh canxi (ω-conotoxin), natri
(μ-, μO- và δ- conotoxin) và kali (κ- conotoxin), chất vận chuyển norepinephrine (χ-conopeptide), thụ thể (receptor) acetylcholine nicotinic (α-conotoxin), α 1-adrenoceptor (ρ-conopeptide), thụ thể NMDA (conantokins), thụ thể vasopressin (conopressin) và thụ thể neurotensin (contulakins).
Độc tố ốc cối được phân ra thành 6 nhĩm (superfamily) (A-, M-, O-, P-, S-, và T-) dựa trên khung cystein của chúng, sự tương đồng của trình tự pre-pro của gen, kiểu cuộn và tác dụng sinh lý. Chúng được biết cĩ hoạt tính giảm đau, chống động kinh, bảo vệ tim, bảo vệ thần kinh, do đĩ chúng trở nên các cơng cụ hữu ích trong nghiên cứu ung thư, cơ thần kinh và rối loạn tâm lý (Jon-Paul Bingham, 2010).
Ở nước ta cĩ khoảng 76 lồi ốc cối được thu thập (Hylleberg và cs, 2003) nhưng chưa được nghiên cứu nhiều về độc tính.
Cơng trình này nhằm khảo sát bước đầu cấu tạo tuyến độc tố và đặc trưng phổ sắc ký tồn thể của các peptid cĩ khối lượng phân tử dưới 10.000 dalton từ độc tố ba lồi ốc cối khá phổ biến ở vùng biển Khánh Hịa và các vùng biển miền Trung là
Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu ốc cối Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum thu thập tại vùng biển Nha Trang - Khánh Hịa, được rửa sạch, thấm khơ và cất giữ ở - 700C trước khi phân tích.
2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Giải phẫu tách tuyến nọc độc
Ốc được rửa sạch, để ráo nước, dùng búa đập vỡ vỏ ốc, gắp nội quan cho vào đĩa petri. Dùng dao mổ và kéo cắt tại vị trí chứa tuyến nọc độc. Mọi thao tác giải phẫu đều tiến hành trên các túi đá lạnh để đảm bảo giữ nguyên tính chất sinh học của tuyến nọc độc. Sau khi tách được tuyến nọc độc ra dùng panh, dao nhọn và kéo cắt nhỏ, nghiền nhuyễn trong dung dịch TFA:ACN = 1:1 để hịa tan độc tố.
Sau đĩ đem ly tâm, loại bỏ cặn và thu dịch lọc. Làm lạnh ở -200C trong 6 giờ sau đĩ đem đơng khơ dịch lọc này trong 24 giờ ta thu được độc tố ốc thơ.
2.2. Chuẩn bị mẫu phân tích cho HPLC/MS
Lấy 2mg độc tố thơ thêm 0,25ml pha động A (TFA 1%), 0,25ml pha động B (ACN:H2O = 9:1) cho vào ống ly tâm cĩ đầu lọc, đầu lọc này chỉ cho những phân tử cĩ khối lượng dưới 10.000 Da đi qua. Sau đĩ đem ly tâm lạnh 10.000 vịng/phút trong 1 giờ. Lấy 200μl dịch sau ly tâm thêm 400μl pha động A, 400μl pha động B đem phân tích bằng máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Hĩa chất được sử dụng thuộc loại dùng cho HPLC.
2.3. Xác định phổ các peptid trong độc tố conotoxin bằng HPLC
Máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) với detector UV-VIS, cột sắc ký ngược pha RP C18 (Thermo sicentifi c, Mỹ), 150 x 4,6mm nhồi RP-18 cỡ 5μm. Pha động: Dung dịch ACN:H2O = 9:1; TFA 1%. Detector UV-VIS: bước sĩng 254nm. Lưu lượng dịng: 0,5mL/phút. Thể tích tiêm: 20μl/ mỗi lần thí nghiệm. Nhiệt độ sắc ký: nhiệt độ phịng. Khảo sát chương trình chạy gradient tại các thời gian 60, 90 và 120 phút.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN