II Thách thức
2.Thu mẫu, định danh và bảo quản mẫu
S.vietnamense được thu ở Bãi Cạn Lớn - Vịnh Nha Trang - Khánh Hồ vào 3/2011. Rong được
TS. Lê Như Hậu (Chuyên gia ngành Thủy sinh học) phân loại và định danh. Sau khi thu mẫu, rong được rửa sạch bằng nước mặn, phơi khơ đến hàm ẩm 19% và bảo quản ở nhiệt độ thường.
3. Phương pháp nghiên cứu
3.1. Bố trí thí nghiệm
Tối ưu hĩa thơng số chiết bằng phương pháp RSM [6]. Mơ hình Box-Behnken được sử dụng. Nhiệt độ chiết (X1), thời gian chiết (X2) và tỷ lệ dung mơi: nguyên liệu (DM : NL) (X3) là biến độc lập. Vùng biến nghiên cứu đã được mã hĩa của 3 biến độc lập được thể hiện ở bảng 1 dựa trên kết quả thực nghiệm nhân tố đơn. Phương án thí nghiệm bao gồm 12 thí nghiệm nhân tố và 3 thí nghiệm lặp lại ở tâm phương án (bảng 2). Phlorotannin và hoạt tính chống oxy hĩa được lựa chọn dựa vào kết quả tổ hợp các biến độc lập ở bảng 2. Thí nghiệm lặp lại 3 lần đối với mỗi điểm thí nghiệm và giá trị cĩ nghĩa được thể hiện trong quan sát. Thí nghiệm được thực hiện ngẫu nhiên để giảm thiểu những tác động của biến đổi bất thường trong các quan sát. Các biến được mã hĩa theo phương trình sau đây:
x = (Xi - X0)/ ∆X
Ở đây x là biến mã, Xi là biến thực, X0 là biến tại thí nghiệm trung tâm, và ΔX là hiệu số giữa giá trị tuyệt đối cực đại của biến thực và giá trị X0. Phương trình tốn học ứng với mơ hình thí nghiệm Box-Behnken như sau:
Ở đây Y là hàm mục tiêu, β0 là hệ số tự do, βi, βiivà βijlà hệ số tuyến tính, và ε sai số. Các hệ số thể hiện ảnh hưởng tuyến tính hay phi tuyến lên các biến. Yêu cầu các hàm mục tiêu (HMT):
Y1: Hàm lượng polyphenol/phlorotannin (mg/g DW): max
Y2: Hoạt tính chống oxy hĩa tổng (mg acid ascorbic/ g DW): max
Y3: Hàm lượng FeSO4 (mg FeSO4/ g DW): max
3.2. Phương pháp định lượng
Định lượng phlorotannin tổng số (TPC) theo phương pháp sử dụng Folin-Ciocalteu được mơ tả bởi Swanson và cộng sự (2002) [15] với phloroglucinol là chất chuẩn. Cách thức tiến hành: lấy 300μl dịch mẫu bổ sung 01 ml Folin-Ciocalteu 10%, giữ 5 phút. Sau đĩ thêm vào 2ml Na2CO3 10%, trộn đều, giữ 90 phút trong bĩng tối và đo độ hấp thụ quang ở bước sĩng 750nm trên máy UV-Vis Spectrophotometer JenWay 6400/ 6405.
3.3. Phương pháp thử hoạt tính
Hoạt tính chống oxy hĩa tổng (TA) được xác
định theo phương pháp của Prieto (1999) [14]. Cách thức tiến hành như sau: lấy 100µl mẫu bổ sung 900µl nước cất và thêm 3ml dung dịch A (H2SO4 0,6 M, sodium phosphate 28mM và ammonium Molybdate 4mM). Hỗn hợp được giữ 90 phút ở 950C. Sau đĩ đo ở bước sĩng 695nm với chất chuẩn là acid ascorbic.
Hoạt tính khử Fe (RP) được xác định theo phương pháp của Zhu và cộng sự (2002) [19]. Cách thức tiến hành như sau: lấy 500µl dịch mẫu bổ sung 0,5ml đệm phosphate pH 7,2 và 0,2ml K3[Fe(CN)6] 1%. Giữ hỗn hợp 20 phút ở 500C. Sau đĩ thêm vào
500µl CCl3COOH 10% với sự bổ sung 300µl nước cất và 80µl FeCl3 0,1%. Tiếp theo đo ở bước sĩng 655 nm với chất chuẩn là FeSO4.
Hoạt tính bắt gốc tự do (DPPH) tiến hành theo Blois cùng cộng sự [1]. Cách thức tiến hành như sau: lấy lần lượt 200µl, 400µl, 600µl, 800µl và 1000µl dịch chiết cho vào 5 ống nghiệm, rồi bổ sung 3ml DPPH (25mg/l) vào từng ống nghiệm làm dung dịch mẫu (mẫu). Ở dung dịch trắng (mẫu trắng) làm tương tự nhưng thay DPPH bằng 3ml cồn tuyệt đối vào từng ống. Mẫu kiểm sốt chuẩn bị bằng cách làm giống như mẫu trắng nhưng thay dịch chiết bằng DPPH. Giữ các hỗn hợp trong tối ở nhiệt độ phịng. Sau 30 phút tiến hành đo ở bước sĩng 550nm. Cơng thức tính phần trăm bắt gốc như sau:
3.4. Phân tích và xử lý số liệu
Phân tích dữ liệu và tiên đốn bề mặt đáp ứng bằng phần mềm Nemrodw và Excell. Thí nghiệm bổ sung được sử dụng để thẩm tra tính phù hợp của
thiết kế thí nghiệm thống kê. Thí nghiệm lặp lại 3 lần (n=3).
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN