- O CH2 COOH phõn ly
4. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN
4.3.2. Chuẩn bị húa chất
- Dung dịch A : được pha bằng cách trụ̣n lõ̃n các dung dịch A 1, A2, A3 theo tỉ lợ̀ lõ̀n lượt là 100:1:1
+ Dung dịch A1 : Na2CO3pha trong nước cṍt theo tỉ lợ̀ 2% (w/v) + Dung dịch A2 : CuSO4.5H2O pha trong nước cṍt theo tỉ lợ̀ 1% (w/v)
+ Dung dịch A 3 : K-Na tartrate (muụ́i Seignet ) pha trong nước cṍt theo tỉ lợ̀ 2% (w/v)
- Dung dịch NaOH 2N
- Thuụ́c thử Folin (dạng thương mại): sử dụng ở nụ̀ng đụ̣ 1N
- Dung dịch pro tein chuõ̉n: sử dụng protein tinh thờ̉ (thường dùng là Albumin huyờ́t thanh bò ) pha với nước cṍt đờ̉ tạo thành dung dịch protein chuõ̉n có nụ̀ng đụ̣ 2 mg/ml (khi chưa dùng đờ́n thì dung dịch này cõ̀n được bảo quản ở nhiợ̀t đụ̣ -200
C), từ nụ̀ng đụ̣ protein chuõ̉n này lõ̀n lượt pha thành dãy dung dịch protein với các nụ̀ng đụ̣ khác nhau thay đụ̉i từ 0àg/ml đờ́n 1000àg/ml theo bảng sau:
Bảng 3.2. Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn
Protein chuõ̉n 2mg/ml (àl) 0 2,5 5 12,5 25 50 125 250 Nước cṍt (àl) 500 497,5 495 487,5 475 450 375 250 Hàm lượng protein (àg/ml) 0 10 20 50 100 200 500 1000 4.3.3. Tiến hành thớ nghiệm
- Cho vào ụ́ng nghiợ̀m 0,1 ml dung dịch mõ̃u cõ̀n xác định hàm lượng protein , sau đó thờm vào 0,1 ml dung dịch NaOH 2N. Đặt ụ́ng nghiợ̀m ở 1000C trong bụ̀n ụ̉n nhiợ̀t hoặc trờn bờ́p đun sụi cách thủy trong 10 phỳt.
- Đờ̉ nguụ̣i, thờm vào 1 ml dung dịch A , lắc đờ̀u, đặt ở nhiợ̀t đụ̣ phòng trong 10 phỳt.
- Thờm vào 0,1 ml thuụ́c thử Fol in, đờ̉ trờn máy lắc , lắc đờ̀u trong thời gian từ 30ữ 60 phỳt (khụng nờn đờ̉ quá 60 phỳt)
- Sau thời gian trờn, xác định cường đụ̣ màu dung dịch ở bước sóng 750 nm nờ́u hàm lượng protein mõ̃u dưới 500 mg/ml hoặc so màu ở bước sóng 550 nm nờ́u hàm lượng protein trong khoảng 100 ữ 2000 mg/ml.
- Tiờ́n hành các bước tương tự như trờn với dung dịch protein chuõ̉n ở các nụ̀ng đụ̣ đã được pha như bảng trờn , từ đó xõy dựng được phương trình hụ̀i qui hoặc đường chuõ̉n biờ̉u diờ̃n sự tương quan giữa cường đụ̣ màu và hàm lượng protein.
- Dựa vào đường chuõ̉n và từ cường đụ̣ màu đo được của dung dịch mõ̃u xác định được hàm lượng protein của mõ̃u.