C hỉnh pH 5,5 ụ đặc dịch
a. Tạo liờn kết đồng húa trị giữa chất mang và enzyme
Trong trường hợp này, các chṍt mang phải được lựa chọn đờ̉ thừa mãn mụ̣t sụ́ điờ̀u kiợ̀n sau:
E Chất mang Chất mang Chất mang E E E E E
- Chṍt mang sau khi tạo liờn kờ́t đụ̀ng hóa trị với enzyme khụng gõy tác dụng kìm hãm đờ́n hoạt đụ̣ng của enzyme, tức khụng gõy ảnh hưởng đờ́n trung tõm hoạt đụ̣ng của chúng.
- Chṍt mang có bản chṍt háo nước, vì nờ́u chṍt mang kỵ nước thì sẽ tác đụ̣ng xṍu đờ́n khả năng tương tác giữa cơ chṍt và phõn tử enzyme vừa được gắn lờn cơ chṍt dõ̃n đờ́n làm giảm hoạt tính của enzyme.
- Chṍt mang phải có các nhóm chức có khả năng tạo liờn kờ́t đụ̀ng hóa trị với phõn tử enzyme. Chúng ta đờ̀u biờ́t enzyme là những phõn tử protein làm nhiợ̀m vụ xúc tác, nờn trong phõn tử thường có những nhóm chức dờ̃ tham gia phản ứng đờ̉ tạo liờn kờ́t đụ̀ng hóa trị như nhóm: −COOH ; ε-NH2 ; −OH ; −SH.
Mụ̣t sụ́ dạng liờn kờ́t đụ̀ng hóa trị giữa chṍt mang và phõn tử enzyme đã được tạo thành cụng, có thờ̉ liợ̀t kờ như sau:
Chṍt mang −N = N−enzyme Chṍt mang −CO−NH−enzyme Chṍt mang −CH2 −NH−enzyme Chṍt mang −CH = enzyme Chṍt mang −S−S−enzyme
Qua đó, có thờ̉ thṍy các chṍt mang muụ́n tạo được liờn kờ́t cũng thường cũng có những nhóm chức như −COOH ; −NH2 ; −OH ; −SH.
Đờ̉ gắng enzyme vào chṍt mang theo kiờ̉u: Chất mang −N = N−enzyme, người ta dùng phản ứng kờ́t hợp với muụ́i diazonium. Chṍt mang phải có mạch vòng chứa nhóm amin như vòng phenol của thirozil hay vòng imidazol của histidine , sau đó hoạt hóa đờ̉ tạo thành hợp chṍt diazod, quá trình có thờ̉ tiờ́n hành theo sơ đụ̀ dưới đõy:
Phương pháp này , chṍt mang thường hay sử dụng là aminobenzoyl -cellulose hoặc là thủy tinh.
Đờ̉ gắng enzyme vào chṍt mang theo kiờ̉u: Chất mang −CO−NH−enzyme, người ta thường sử dụng chṍt mang là ester metylic của carboxymethylcellulose , sau đó, người ta chuyờ̉n hóa nó thành dõ̃n xuṍt azoture , chṍt này tác dụng với enzyme ở nhiợ̀t đụ̣ thṍp sẽ tạo thành mụ̣t liờn kờ́t ở dạng amid.
OO O O O O O O O Cellulose Cellulose Cellulose Cellulose H2 H2 H2 H2 H3 C C C C C N N N C C C C N Enzym Enzym /H N N N NH N H2 H2 NaNO2 H2 H2
Đụ́i với những enzyme cú nhúm -SH ở trung tõm hoạt đụ̣ng, trong quá trình điờ̀u chờ́, điờ̀u cõ̀n thiờ́t là phải bảo vợ̀ nhóm SH của enzyme, vì nó dờ̃ dàng tạo liờn kờ́t với các dõ̃n xuṍt azoture và dõ̃n đờ́n làm vụ hoạt enzyme.
Đờ̉ tạo dạng liờn kờ́t Chṍt mang −CH2 −NH−enzyme, người ta sử dụng phương phỏp alkyl húa.
Thực hiợ̀n trùng hợp nhóm amin , phenol hoặc nhóm –SH của protein với mụ̣t nhóm halogen của chṍt mang (bromoacetyl cellulose hay iodoacetylcellulose) theo sơ đụ̀ sau:
O O
O O
Cellulose C CH2 Br Enzym NH2 Cellulose C CH2 NH Enzym
Ưu điờ̉m của phương pháp này là liờn kờ́t giữa chṍt mang và enzyme có đụ̣ bờ̀n cao nờn trong thời gian sử dụng khó bị đứt, lượng enzyme khó bị tụ̉n thṍt, do đó, chờ́ phõ̉m enzyme loại này rṍt thích hợp đờ̉ sử dụng trong các bờ̉ lờn men liờn tục.
Nhược điờ̉m của phương pháp là khó thực hiợ̀n và lượng enzyme cụ́ định trờn cơ chṍt thường thṍp hơn so với các phương pháp khác, đụ̀ng thời khi tạo liờn kờ́t bờ̀n với cơ chṍt rṍt dờ̃ làm thay đụ̉i cṍu trúc khụng gian của phõn tử enzyme dõ̃n đờ́n làm giảm khả năng xúc tác.