V (ml) =
1 - S2
Cõ̀n phải chú ý khi thực hiợ̀n quá trình lắng tủa protein bằng (NH4)2SO4 cõ̀n phải tách kim loại nặng , đặc biợ̀t là sắt ra khỏi muụ́i . Đờ̉ làm điờ̀u đó , trước khi tủa bằng muụ́i (NH4)2SO4 phải bụ̉ sung vào dung dịch tác nhõn gắn kim loại , chẳng hạn như EDTA.
3.1.3. Phương phỏp kết tủa protein bằng dung mụi hữu cơ
Dung mụi hữu cơ có khả năng ảnh hưởng rṍt lớn đờ́n đụ̣ hòa tan của của protein , ảnh hưởng đờ́n trạng thái sovat hóa của phõn tử nước xung quanh phõn tử protein , tương tác giữa các phõn tử protein sẽ tăng lờn.
Trong cụng nghiợ̀p sản xuṍt enzyme, người ta thường sử dụng ethanol và acetone đờ̉ kờ́t tủa enzyme.
Khi tiờ́n hành kờ́t tủa enzyme bằng các dung mụi hữu cơ cõ̀n hờ́t sức lưu ý đờ́n yờ́u tụ́ nhiợ̀t đụ̣. Do enzyme rṍt nhạy cảm với nhiợ̀t đụ̣ khi có mặt các chṍt như ethanol và acetone, nờn bắt buụ̣c khi tiờ́n hành kờ́t tủa enzyme phải làm lạnh cả dung mụi hữu cơ và dung dịch enzyme.
Mức đụ̣ nhạy cảm nhiợ̀t đụ̣ của enzyme khi có mặt các dung mụi hữu cơ thường mạnh hơn mức đụ̣ nhạy cảm của enzyme với nhiợ̀t đụ̣ khi có mặt của muụ́i vụ cơ . Người ta thường tiờ́n hành kờ́t tủa enzyme bằng dung mụi hữu cơ ở nhiợ̀t đụ̣ trong khoảng 3ữ100C.
Tỷ lợ̀ và nụ̀ng đụ̣ các dung mụi hữu cơ dùng đờ̉ kờ́t tủa enzyme được xác định bằng thực nghiợ̀m cho từng loại enzyme và từng nụ̀ng đụ̣ enzyme có trong dung dịch.
Khi cho dung mụi hữu cơ vào dung dịch protein sẽ làm giảm khả năng tan của nước bao xung quanh protein . Hiợ̀n tượng này xảy ra là do sự giảm hằng sụ́ điợ̀n mụ̣i của dung dịch , đõ̉y mụ̣t lượng lớn nước . Các phõn tử protein sắp xờ́p rṍt trọ̃t tự xung quanh các đoạn kỵ nước trờn bờ̀ mặt protein có thờ̉ thay thờ́ bằng các phõn tử dung mụi hữu cơ. Từ đó làm gia tăng đụ̣ hòa tan của chúng. Các protein có tính kỵ nước mạnh sẽ có khả năng hòa tan hoàn toàn trong dung mụi hữu cơ.
Nguyờn nhõn cơ bản của sự kờ́t hợp các phõn tử protein lại với nhau có thờ̉ là do các lực tĩnh điợ̀n , lực Vandewaals (giụ́ng như ở muụ́i ). Tương tác kỵ nước trong trường hợp này khụng có ý nghĩa lớn . Tại điờ̉m đẳng điợ̀n thì sự kờ́t tủa diờ̃n ra tụ́t nhṍt, khi đó lượng dung mụi hữu cơ sử dụng cho quá trình tủ a là ít nhṍt, do đó, đờ̉ hạn chờ́ lượng dung mụi cõ̀n sử dụng đờ̉ kờ́t tủa protein , pH của dung dịch protein phải được điờ̀u chỉnh sao cho đúng với giá trị điờ̉m đẳng điợ̀n của protein mục tiờu.
Có thờ̉ xảy ra hiợ̀n tượng biờ́n tí nh khụng thuọ̃n nghịch khi kờ́t tủa protein bằng dung mụi hữu cơ . Nguyờn nhõn là do , khi hằng sụ́ điợ̀n mụi giảm phõn tử protein có thờ̉ tự tháo gỡ và tạo thành dạng khụng hoạt đụ̣ng , trong khi đó các gụ́c kỵ nước lại tiờ́p xúc với dung mụi. Hiợ̀n tượng này xảy ra khi tiờ́n hành tủa ở nhiợ̀t đụ̣ phũng, nờ́u thực hiợ̀n ở 4ữ100C sẽ hạn chờ́ đờ́n mức thṍp nhṍt sự biờ́n tính protein.
3.1.4. Kết tủa protein bằng polymer
Polyethylen glycol là mụ̣t polymer cao phõn tử đ ược ứng dụng rụ̣ng rãi trong viợ̀c kờ́t tủa protein.
Nhiờ̀u tác giả cho rằng cơ chờ́ lắng của chúng gõ̀n giụ́ng dung mụi hữu cơ . Phương pháp này có ưu điờ̉m là ta có thờ̉ thực hiợ̀n quá trình kờ́t tủa protein ở nhiợ̀t đụ̣ thường (nhiợ̀t đụ̣ phòng thí nghiợ̀m) và lượng polyethylen glycol sử dụng khụng nhiờ̀u (khoảng 5ữ15 %). Nờ́u sử dụng ở nụ̀ng đụ̣ cao sẽ làm đụ̣ nhớt của dung dịch rṍt cao và như thờ́ sẽ làm khó khăn cho kỹ thuọ̃t làm sạch sau này . Polymer được sử dụng rṍt rụ̣ng rãi đờ̉ kờ́t tủa protein cả trong nghiờn cứu và trong sản xuṍt protein theo quy mụ cụng nghiợ̀p. Các polymer được sử dụng nhiờ̀u đờ̉ kờ́t tủa protein là polyethylen amine và polyethylene glycol với những khụ́i lượng phõn tử khác nhau.
3.2. Một số phương pháp sắc ký sử dụng để tinh chế protein
3.2.1. Khỏi quỏt chung vờ̀ sắc ký
Phương pháp sắc ký là phương pháp cơ bản quan trọng nhṍt đờ̉ làm sạch protein, các phương pháp sắc ký được tóm tắt trong bảng 2.1
Bảng 2.1. Những phương phỏp sắc ký
STT Phương pháp Nguyờn tắc Mục đớch tách
1 Sắc ký hṍp phụ (Adsorption)
Liờn kờ́t bờ̀ mặt Ái lực bờ̀ mặt (Surface affinity) 2 Sắc ký phõn bụ́
(distribution)
Phõn bụ́ cõn bằng
(distribution equilibrium)
3 Sắc ký trao đụ̉i ion Liờn kờ́t ion Vọ̃t mang
4 Sắc ký lọc gel Khuờ́ch tán qua lụ̃ lọc Kích thước phõn tử 5 Sắc ký kỵ nước Hṍp thụ đặc hiợ̀u Cṍu trúc phõn tử 6 Sắc ký đụ̀ng hóa trị Liờn kờ́t đụ̀ng hóa trị Phõn cực
7 Sắc ký tạo vòng kim loại Tạo phức Cṍu tạo phõn tử 8 Sắc ký ái lực (Affinity) Hṍp thụ đặc hiợ̀u Cṍu trúc phõn tử
3.2.2. Sắc ký trao đổi ion
Phương pháp sắc ký trao đụ̉i ion dựa vào sự khác nhau vờ̀ điợ̀n tích tụ̉ng sụ́ của cỏc protein enzyme. Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trờn cơ sở của phản ứng trao đụ̉i ion giữa protein (được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loóng) và các tác nhõn trao đụ̉i ion. Tác nhõn (hay nguyờn liợ̀u) trao đụ̉i ion có thờ̉ là chṍt nhựa có tích nhóm sinh ion hoặc là chṍt ionit. Đõy là những chṍt giá trơ, khụng tan trong nước, có bản chṍt là cellulose hoặc chṍt gel dextran có lưới phõn nhánh (Sephadex, Molselect) hoặc là chṍt nhựa polystirol. Chṍt giá thờ̉ này thường kờ́t hợp với các nhóm ion húa.
Các chṍt trao đụ̉i ion có chṍt giá là cellulose, sephadex, molselect thụng thường được dùng đờ̉ tách protein enzyme, còn các chṍt trao đụ̉i ion có chṍt giá là polystirol (ví dụ như Dowex, Amberlite) chỉ dùng đờ̉ tách các peptid có trọng lượng phõn tử nhỏ hơn.
Cationit CM - cellulose (carboxylmetyl - cellulose) - là mụ̣t dõ̃n xuṍt este của cellulose. Cellulose - O - CH2 – COOH. Khi phõn li cho ra COO-. Đõy là chṍt trao đụ̉i cation. Trờn những cationit, thì các protein kiờ̀m có thừa những nhóm amin và những nhóm kiờ̀m khác được hṍp phụ. Sự hṍp phụ trờn các cationit được tiờ́n hành với những dung dịch loãng ở pH 1,5 - 6,5. (Các protein kiờ̀m có chứa các amino acid diamino - mono carboxylic như lys, Arg, His) Anionit DEAE - cellulose (diethylamino - ethyl - cellulose) là dõ̃n xuṍt este của cellulose.)
C2H5
Cellulose - O - CH2 - CH2 - N
C2H5
Trong H2O nó được phõn ly:
Cellulose - O - C2H4 - N - (C2H5)2 + H2O C2H5
Cellulose - O - C2H4 - N+ + OH - C2H5
H
Đõy là chṍt trao đụ̉i anion
Các anionit được áp dụng đờ̉ phõn tích các protein acid có thừa những nhóm carboxyl tự do. Sự hṍp phụ protein trờn những ionit như vọ̃y được tiờ́n hành với những dung dịch đợ̀m có lực ion thṍp (0,005ữ0,1M) ở pH 7,5ữ8,5, (các protein acid có chứa cỏc amino acid monoamin).
Trong hụ̃n hợp chṍt ionit với dung dịch đợ̀m có đụ̣ pH tương ứng, các chṍt ionit đã nói ở trờn trở nờn tích điợ̀n,. Vì vọ̃y trờn bờ̀ mặt lớp chṍt giá sẽ hình thành mụ̣t lớp điợ̀n tích có dṍu phụ thuụ̣c vào kiờ̉u nhóm chức hóa học của nó. Nờ́u thờm protein vào dung dịch đợ̀m thì các phõn tử protein mang điợ̀n tích sẽ bị các nhóm tích điợ̀n trái dṍu của chṍt trao đụ̉i ion kộo lại.
Khi dùng mụ̣t dung dịch đợ̀m đờ̉ phản hṍp phụ có pH khác hoặc khi thờm mụ̣t loại ion khác có lực ion lớn hơn thì phõn tử protein enzyme sẽ bị đõ̉y ra khỏi chṍt trao đụ̉i ion. Khi tiờ́n hành phản hṍp phụ, thường người ta thờm vào các ion Na+
và Cl- trong NaCl có nụ̀ng đụ̣ tăng dõ̀n theo bọ̃c thang hay theo gradient.
Các phõn tử protein nào có điợ̀n tích tụ̉ng sụ́ nhỏ thì sẽ bị đõ̉y ra trước do lực liờn kờ́t với chṍt trao đụ̉i ion yờ́u. Còn những protein nào có liờn kờ́t với ionit lớn hơn thì sẽ bị đõ̉y ra bằng mụ̣t lực ion của muụ́i lớn hơn. Như vọ̃y, bằng cách này, chúng ta có thờ̉ tách được từng phõ̀n các loại enzyme. Viợ̀c tách từng phõ̀n có lựa chọn tụ́t nhṍt là khi tăng dõ̀n nụ̀ng đụ̣ các ion thay thờ́. Nhờ nụ̀ng đụ̣ ion của muụ́i tăng dõ̀n (gradient) người ta có thờ̉ rút ra từ cụ̣t các loại protein enzyme khác nhau. Có thờ̉ thu nhọ̃n dịch chiờ́t protein sau khi qua cụ̣t bằng máy thu phõn đoạn tự đụ̣ng. Theo thứ tự từng phõ̀n dịch thu được, người ta tiờ́n hành định lượng protein theo các phương pháp Lowry hay phương pháp đo quang phụ̉ và xác định hoạt đụ̣ của enzyme. Ngoài viợ̀c dùng muụ́i NaCl cho cỏc ion Na+ và Cl-, người ta có thờ̉ dùng các loại muụ́i khác như KCl, Na3PO4.
Nờ́u chṍt giá là sephadex thì chúng ta có chṍt trao đụ̉i ion sephadex. Đó là các loại DEAE - sephadex và CM - sephadex. Ưu điờ̉m của loại này là vừa tách được protein enzyme vờ̀ kích thước và vờ̀ điợ̀n tích tụ̉ng sụ́ của các protein enzyme. Trường hợp CM - sephadex trờn chṍt giá sephadex có gắn nhóm COO-