Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford

- O CH2 COOH phõn ly

4.4.Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford

4. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN

4.4.Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford

4.4.1. Nguyờn tắc

Phương phỏp này dựa trờn sự thay đụ̉i bước súng hṍp thu cực đại của thuụ́c nhuụ̣m Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein.

Hỡnh 3.5. Cụng thức phõn tử của Coomasie Brilliant Blue G-250

Trong dung dịch mang tớnh acid, khi chưa kờ́t nụ́i với protein thỡ thuụ́c nhuụ̣m cú bước sóng hṍp thu cực đại 465 nm; khi kờ́t hợp với protein thỡ thuụ́c nhuụ̣m hṍp thu cực đại ở bước súng 595 nm. Đụ̣ hṍp thụ ở bước súng 595 nm cú liờn hợ̀ mụ̣t cỏch trực tiờ́p tới nụ̀ng đụ̣ protein.

dịch protein chuõ̉n đó biờ́t trước nụ̀ng đụ̣. Dung dịch protein chuõ̉n thường là bovine serum albumin. Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuụ́c nhuụ̣m, màu sẽ xuṍt hiợ̀n sau 2 phỳt và bờ̀n tới 1 giờ. Tiờ́n hành đo dung dịch bằng mỏy quang phụ̉ kờ́ ta được ODx, đụ̣ hṍp thụ sẽ tỷ lợ̀ với lượng trong mõ̃u. Thực hiợ̀n mụ̣t đụ́i chứng với nước cṍt (OD0). Lṍy giỏ trị OD = ODx - OD0. Lượng protein mõ̃u trong dung dịch đo được xỏc định bằng cỏch chṍm trờn đường chuõ̉n theo OD, lṍy giỏ trị của điờ̉m đó trờn trục hoành. Đú chớnh là lượng protein mõ̃u trong dung dịch đo.

4.4.2. Chuẩn bị

- Cụ̀n 900

- Dung dịch protein chuõ̉n: cõn 10 mg albumin bằng cõn phõn tớch, pha trong 1 ml nước cṍt, lắc đờ̀u cho tan. Giữ ở -200C. Khi dựng pha loóng ra 100 lõ̀n, được dung dịch cú nụ̀ng đụ̣ 0,1 mg/ml.

- Dung dịch thuụ́c thử Bradford: dung dịch thuụ́c thử cú thành phõ̀n trong 100ml như sau:

+ Coomassie Brilliant Blue: 0,005g + Ethanol tuyợ̀t đụ́i: 4,7g

+ Phosphoric acid 85%: 8,5g

Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong một chai đựng màu tối cú nắp. Bổ sung phosphoric acid và chỉnh tới 100ml bằng nước cất. Lắc đều, giữ ở 40C

- Dung dịch cõ̀n xỏc định hàm lượng protein (phũng thớ nghiợ̀m cung cṍp)

4.4.3. Tiến hành

- Lọ̃p mụ̣t loạt 6 ụ́ng theo sụ́ thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5 và 1 ụ́ng nghiợ̀m chứa mõ̃u cõ̀n phõn tớch X

- Bụ̉ sung cỏc thành phõ̀n như bảng sau, riờng ụ́ng nghiợ̀m X cho 1 ml mõ̃u cõ̀n phõn tớch do phũng thớ nghiợ̀m cung cṍp (nờ́u cõ̀n sinh viờn tự pha loóng mõ̃u trước khi phõn tớch)

- Dựng đụ̀ng hụ̀ bṍm giõy, canh thời gian 0 phỳt cho 5ml thuụ́c thử vào ụ́ng nghiợ̀m 0, lắc đờ̀u đờ̉ yờn. Ở thời điờ̉m 1 phỳt cho 5ml thuụ́c thử vào ụ́ng nghiợ̀m 1, lắc đờ̀u đờ̉ yờn,... cứ tiờ́p tục cho đờ́n hờ́t.

Bảng 3.3. Xõy dựng đường chuẩn và xỏc định hàm lượng protein mẫu

ễ́ng nghiợ̀m 0 1 2 3 4 5 X

Nước cṍt (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 - Albumin chuõ̉n 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 -

TT Bradford 5 5 5 5 5 5 5

Nụ̀ng đụ̣ protein (mg/ml) 0 10 20 30 40 50 ?

- Tính thời gian ụ́ng 0 được 20 phút, tiờ́n hành đo đụ̣ hṍp thu của dung dịch ở bước sóng 595 nm. Ta có giá trị OD0, ở thời điờ̉m 21 phút đo ụ́ng 1 (OD1),... tương tự cứ cách mụ̣t phút đo cho hờ́t các ụ́ng. Ghi lại giá trị OD.