- O CH2 COOH phõn ly
5. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME 1 Nguyờn tắc chung
5.3.6. Phương phỏp xỏc định hoạt độ enzyme urease
Hoạt đụ̣ urease được xác định theo phương pháp so màu với thuụ́c thử Nesler.
a.Nguyờn tắc :
Dùng phản ứng màu với thuụ́c thử Nesler đờ̉ định lượng amoniac được tạo thành trong phản ứng dưới tác dụng urease.
1 đơn vị hoạt tính urease là lượng enzyme có thờ̉ tạo thành 1 àmol amonia mụ̃i phút ở 30oC trong đợ̀m phosphat pH = 6.5.
b. Tiến hành:
Cho vào ụ́ng nghiợ̀m 0,4 ml nước cṍt và 0,5 ml dung dịch urea 3% trong đợ̀m phosphat 0,5M, pH=7.
Giữ ụ́ng nghiợ̀m trong tủ ṍm đờ́n khi đạt 30o
C. Sau đó thờm 0,1 ml dung dịch urease có đụ̣ pha loãng thích hợp, lắc đờ̀u, giữ 30 o
C trong 5 phỳt.
Làm ngừng phản ứng bằng cách thờm 0,5 ml dung dịch HCl 1M lắc đờ̀u.
Xác định amoniac như sau: lṍy 0,15 ml hụ̃n hợp phản ứng cho vào ụ́ng nghiợ̀m , thờm 7 ml nước, 0,5 ml thuụ́c thử Nesler và thờm nước vào đờ́n 10 ml.
Lắc đờ̀u, so màu trờn máy quang điợ̀n với kính lọc màu xanh lục. Mõ̃u đụ́i chứng: thay 0,15 ml hụ̃n hợp phản ứng bằng nước cṍt.
c.Húa chất:
- Dung dịch enzyme cõ̀n điờ̀u chỉnh pH đờ́n 6,5. Cõ̀n pha loãng dung dịch enzyme thờ́ nào đờ̉ 0,1 ml enzyme trong điờ̀u kiợ̀n thí nghiợ̀m tạo thành 0,1 – 0,25 mg nitơ amoniac.
- Thuụ́c thử Nesler: hũa tan 10 g KI trong 15 ml nước cṍt, thờm 15g HgI2, khuṍy cõ̉n thọ̃n và thờm 80 ml dung dịch NaOH 50%. Khuṍy đờ̀u, thờm nước cṍt cho đờ́n 500 ml. Đờ̉ mụ̣t ngày đờm ở trong phòng , lọc qua bụng thủy tinh , nhọ̃n được dung dịch trong suụ́t.
d.Lập đồ thị chuẩn:
Chuõ̉n bị dung dịch gụ́c NH4Cl hoặc (NH4)2SO4 có chứa 50àg amoniac/1ml. Lṍy 7 bình định mức 10 ml, cho vào mụ̃i bình 8 ml nước cṍt. Hai bỡnh dựng làm mõ̃u đụ́i chứng đờ̉ so màu , 5 bình còn lại, cho thờm vào các bình theo thứ tự 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1 ml dung dịch gụ́c.
Thờm vào tṍt cả 7 bỡnh mụ̃i bình 0,5 ml thuụ́c thử Nesler, thờm nước cṍt vào cho đờ́n vạch 10 ml. Lắc đờ̀u, đo OD trờn máy quang điợ̀n kờ́ với kính lọc màu xanh lục.
Thực hiợ̀n phản ứng tương tự như đã ghi ở phõ̀n trờn.
Vẽ đụ̀ thị biờ̉u diờ̃n sự biờ́n t hiờn của mọ̃t đụ̣ quang (∆OD) theo nụ̀ng đụ̣ NH 3
TểM TẮT CHƯƠNG 3
Điợ̀n di là phương pháp nhằm đánh giá mức đụ̣ tinh sạch của protein , cơ sở của phương pháp điợ̀n di đó là các phõn tử protein khác nhau sẽ di chuyờ̉n với vọ̃n tụ́c khác nhau trong điợ̀n trường . Sự di chuyờ̉n khác nhau này có thờ̉ là do kích thước của protein hoặc là do điờ̉m đẳng điợ̀n của protein là khác nhau giữa các loại khác nhau.
Sau khi đã được tinh sạch và điợ̀n di , protein thu được cõ̀n phải được kiờ̉m tra đờ̉ khẳng định chắc chắn đõy là protein mục tiờu cõ̀n thu nhọ̃n . Đờ̉ thực hiợ̀n điờ̀u này , người có thờ̉ thực hiợ̀n nhiờ̀u phương pháp nhưng thong dụng hơn cả đó là phương pháp lai thõ̉m tích (Western Blot), cơ sở của phương pháp này đó là dựa vào khả năng lien kờ́t đặc hiợ̀u giữa protein và kháng thờ̉ tương ứng.
Trong các phương pháp phõn tích protein , xác định hàm lượng protein là nhằm đờ̉ đánh giá lượng protein hiợ̀n di ợ̀n trong đụ́i tượng cõ̀n nghiờn cứu là nhiờ̀u hay ít . Ngoài ra xác định hàm lượng protein còn là cơ sở đờ̉ đánh giá chṍt lượng enzyme thu được thong qua giá trị hoạt đụ̣ riờng . Các phương pháp xác định hàm lượng protein thường s ử dụng là phương pháp quang phụ̉ , phương pháp Lowry , phương pháp Bradford, phương pháp acid bicinchronic.
Trong những nghiờn cứu vờ̀ enzyme, giá trị quan trọng đờ̉ đánh giá chúng đó là khả năng xúc tác phản ứng hay còn gọi là hoạt đụ̣ enzyme. Hoạt đụ̣ enzyme biờ̉u thị qua lượng cơ chṍt bị phõn giải hoặc lượng sản phõ̉m tạo thành sau phản ứng enzyme.
CÂU HỎI ễN TẬP
1- Cơ sở lý thuyờ́t của các phương pháp điợ̀n di trờn gel polyacrylamide.
2- Trình bày nụ̣i dung của phương pháp điợ̀n di SDS-PAGE và điợ̀n di hai chiờ̀u. 3- Nguyờn tắc và tiờ́n trình thực hiợ̀n phương pháp lai thõ̉m tích.
4- Hãy trình bày nụ̣i dung của các phương pháp giải trình tự protein.
5- Hãy trình bày nguyờn tắc của các phương pháp xác định hàm lượng protein. 6- Trình bày các phương pháp xác định hàm lượng protein.
7- Cõ̀n lưu ý những điờ̀u gì khi thực hiợ̀n phản ứng enzyme.
8- Hai phương pháp chính xác định hoạt đụ̣ enzyme là gỡ ? Hóy trỡnh bày nụ̣i dung từng phương pháp.
Chương 4. CễNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME VÀ PROTEIN
Enzyme được sử dụng ngày càng rụ̣ng rãi trong nhiờ̀u lĩnh vực sản xuṍt như nụng nghiợ̀p, cụng nghiợ̀p thực phõ̉m, cụng nghiợ̀p dược, dợ̀t may, thuụ̣c da, sản xuṍt chṍt tõ̉y rửa, trong cụng nghợ̀ gen... Nhu cõ̀u enzyme ngày cang cao, vì vọ̃y viợ̀c sản xuṍt các loại enzyme khác nhau đờ̉ đáp ứng nhu cõ̀u là hờ́t sức cõ̀n thiờ́t. Tương tự enzyme, cỏc protein có hoạt tính sinh học cao như insulin, interferon, hormon rṍt cõ̀n cho viợ̀c bào chờ́ các dược liợ̀u đờ̉ điờ̀u trị bợ̀nh. Những loại protein và enzyme này chủ yờ́u được thu nhọ̃n từ nguụ̀n sinh học. Trong chương này giới thiợ̀u vờ̀ cụng nghợ̀ sản xuṍt mụ̣t sụ́ loại enzyme và protein, chủ yờ́u là các loại enzyme và protein được biờ́t đờ́n nhiờ̀u và có nhu cõ̀u lớn. Các phương pháp giới thiợ̀u có tính tiờu biờ̉u và trong mụ̣t sụ́ trường hợp có thờ̉ áp dụng tương tự cho loại enzyme khác, đặc biợ̀t là các qui trình sản xuṍt enzyme từ vi sinh vọ̃t.