KIấ̉M TRA ĐỘ TINH SẠCH CỦA PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN D

- O CH2 COOH phõn ly

1. KIấ̉M TRA ĐỘ TINH SẠCH CỦA PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN D

ĐIỆN DI

1.1. Điện di SDS-PAGE

1.1.1. Phương thức

Điợ̀n di trờn polyacrylamide gel với sự có mặt của SDS (sodium dodecyl sulfate) là kỹ thuọ̃t dùng trong hóa sinh, di truyờ̀n và sinh học phõn tử đờ̉ phõn tách các protein theo tính linh đụ̣ng điợ̀n di của chúng (phụ thuụ̣c vào chiờ̀u dài của chuụ̃i polypeptide hoặc khụ́i lượng phõn tử, cṍu hình (xoắn) của protein, các biờ́n đụ̉i họ̃u dịch mã và các nhõn tụ́ khác).

Điợ̀n SDS cho phộp phõn ly các phõn tử protein có khụ́i lượng khác nhau. SDS có điợ̀n tích õm rṍt lớn và có khả năng liờn kờ́t với mạch peptide đờ̉ biờ́n tính các cṍu trúc bọ̃c hai và bọ̃c ba (khụng liờn kờ́t bằng cõ̀u disulfide) của protein bằng cách bọc xung quanh khung polypeptide. Như vọ̃y, sụ́ lượng SDS tương tác với protein tỷ lợ̀ với khụ́i lượng/kích thước phõn tử protein và điợ̀n tích của SDS bám vào có thờ̉ làm bṍt cứ phõn tử protein nào cũng chuyờ̉n đụ̣ng trong điợ̀n trường từ cực õm (-) sang cực dương (+). Do đó, bằng phương pháp điợ̀n di, có thờ̉ phõn tách riờng biợ̀t các phõn tử protein có khụ́i lượng phõn tử khác nhau.

Hỡnh 3.1. Điện di protein bằng kỹ thuật SDS-PAGE và nhuộm bằng Coomassie blue.

WM: Chuõ̉n khụ́i lượng phõn tử của protein. Các đường 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8: Mõ̃u protein.

Khụng có SDS, các protein khác nhau có khụ́i lượng phõn tử tương tự sẽ dịch chuyờ̉n khác nhau do sự khác nhau vờ̀ cuụ̣n xoắn, bởi vì những khác nhau trong các

kiờ̉u cuụ̣n xoắn sẽ làm cho mụ̣t vài phõn tử protein thích hợp tụ́t hơn với khuụn gel so với những phõn tử protein khác. Bụ̉ sung SDS giúp giải quyờ́t vṍn đờ̀ này, vì nó làm cho các phõn tử protein trở thành mạch thẳng sao cho chúng có thờ̉ phõn tách hoàn toàn theo khụ́i lượng phõn tử (cṍu trúc sơ cṍp, hoặc sụ́ lượng (và kích thước) của các amino acid). SDS liờn kờ́t với protein theo tỷ lợ̀ khoảng 1,4 g SDS trờn 1,0 g protein (mặc dù tỷ lợ̀ liờn kờ́t có thờ̉ thay đụ̉i từ 1,1ữ2,2 g/SDS/g protein) tạo ra mụ̣t tỷ lợ̀ khụ́i lượng/điợ̀n tích thụ́ng nhṍt cho mọi phõn tử protein đờ̉ sự dịch chuyờ̉n qua gel chỉ liờn quan đờ́n kích thước của protein. Mụ̣t loại thuụ́c nhuụ̣m vờ́t có thờ̉ được bụ̉ sung vào dung dịch protein cho phộp theo dừi tiờ́n đụ̣ của dịch chuyờ̉n protein qua gel trong suụ́t quá trình điợ̀n di.

1.1.2. Khử SDS-PAGE

Bờn cạnh viợ̀c bụ̉ sung SDS, protein có thờ̉ được đun nóng nhanh gõ̀n đờ́n sụi với sự có mặt của mụ̣t tác nhõn khử, ví dụ như dithiothreitol (DTT) hoặc 2-mercaptoethanol (BME), đờ̉ biờ́n tính thờm protein bằng cách khử các liờn kờ́t disulfide, vì thờ́ khắc phục được mụ̣t vài dạng cuụ̣n xoắn bọ̃c ba của protein, và bẻ gãy cṍu trúc bọ̃c bụ́n của protein (các tiờ̉u đơn vị oligomer). Phương thức này được xem như là khử SDS-PAGE, và được sử dụng phụ̉ biờ́n nhṍt. Trường hợp khụng khử SDS- PAGE (khụng đun sụi và khụng có tác nhõn khử) có thờ̉ được dùng khi cṍu trúc nguyờn thờ̉ là quan trọng trong phõn tích vờ̀ sau (chẳng hạn như hoạt tính enzyme, được trình bày bằng viợ̀c sử dụng zymogram). Điợ̀n di polyacrylamide gel liờn tục nguyờn thờ̉ pha chờ́ định lượng (quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis, QPNC-PAGE) là mụ̣t phương pháp mới đờ̉ phõn tách các metalloprotein nguyờn thờ̉ trong các khuụn sinh học phức tạp.

1.1.3. Điện di và nhuộm

Các protein biờ́n tính sau đó được nạp vào mụ̣t đõ̀u của khuụn gel polyacrylamide đặt trong đợ̀m thích hợp. Dòng điợ̀n được sử dụng từ đõ̀u này đờ́n đõ̀u kia của gel, sẽ làm cho các protein tích điợ̀n õm dịch chuyờ̉n qua gel. Tùy thuụ̣c vào kích thước của chúng, mụ̃i protein sẽ dịch chuyờ̉n với các tụ́c đụ̣ khác nhau qua khuụn gel: protein ngắn dờ̃ dàng đi qua các lụ̃ của gel, trong khi protein lớn hơn sẽ gặp khó khăn hơn. Sau mụ̣t vài giờ (tùy thuụ̣c điợ̀n áp sử dụng trờn gel, nờ́u điợ̀n áp cao protein chạy nhanh hơn nhưng sẽ cho đụ̣ phõn giải kộm hơn), các protein sẽ có sự dịch chuyờ̉n khác nhau dựa trờn kích thước của chúng, các protein nhỏ hơn sẽ đi nhanh hơn xuụ́ng phía dưới của gel, trong khi các phõn tử lớn võ̃n còn ở vị trí gõ̀n với điờ̉m xuṍt phát. Vì thờ́, protein có thờ̉ được phõn tách theo kích thước (và vì thờ́, theo khụ́i lượng phõn tử). Sau điợ̀n di, gel được nhuụ̣m (phụ̉ biờ́n nhṍt là Coomassie Brilliant Blue hoặc thuụ́c nhuụ̣m bạc), cho phộp quan sát các protein được phõn tách, hoặc những tiờ́n trình xa hơn (ví dụ: Western blot). Sau khi nhuụ̣m, các protein khác nhau sẽ xuṍt hiợ̀n ở các băng phõn biợ̀t trong gel. Quá trình điợ̀n di thường được chạy kốm với protein marker của các khụ́i lượng phõn tử đã biờ́t ở mụ̣t đường riờng biợ̀t trong gel, đờ̉ canh chỉnh gel và xác định khụ́i lượng của protein chưa biờ́t bằng cách so sánh với khoảng cách dịch chuyờ̉n liờn quan với marker.

Điợ̀n di polyacrylamide gel thường là chọn lựa đõ̀u tiờn khi thử nghiợ̀m sự tinh sạch protein do tính đáng tin cọ̃y và dờ̃ dàng của nó. Sự có mặt của SDS và bước gõy biờ́n tính làm cho các protein được phõn tách đơn đụ̣c dựa trờn kích thước. Các tác nhõn bõ̉n cũng có thờ̉ cùng dịch chuyờ̉n và xuṍt hiợ̀n mụ̣t băng khụng mong muụ́n tương tự protein. Sự đụ̀ng dịch chuyờ̉n này cũng có thờ̉ làm cho mụ̣t protein sẽ chạy ở mụ̣t vị trí khác hoặc khụng thờ̉ xõm nhọ̃p vào gel. Đõy là điờ̀u quan trọng đờ̉ nhuụ̣m

gel hoàn toàn bao gụ̀m phõ̀n stacking. Coomassie blue có ái lực liờn kờ́t yờ́u với glycoprotein và các protein dạng sợi, đã làm cản trở chṍt lượng điợ̀n di.

1.1.4. Hệ thống đệm

Hõ̀u hờ́t điợ̀n di phõn tách protein được thực hiợ̀n với mụ̣t hợ̀ thụ́ng đợ̀m khụng liờn tục tăng cường mụ̣t cách ý nghĩa hình dạng của băng trong gel. Trong suụ́t quá trình điợ̀n di ở hợ̀ thụ́ng gel khụng liờn tục, mụ̣t gradient ion được tạo thành trong giai đoạn sớm của điợ̀n di làm cho tṍt cả protein tọ̃p trung trong mụ̣t băng dạng đơn.

Nhiờ̀u người sử dụng liờn tục đợ̀m Tris-glycine hoặc Laemmli tọ̃p trung và phõn giải ở pH 8,3ữ9,0. Các pH này khởi đụ̣ng sự tạo thành cõ̀u nụ́i disulfide giữa các gụ́c cysteine trong protein, đặc biợ̀t khi chúng hiợ̀n diợ̀n ở nụ̀ng đụ̣ cao do pKa của cysteine nằm trong phạm vi từ 8ữ9 và bởi vì tác nhõn khử hiợ̀n diợ̀n trong đợ̀m nạp (loading buffer) khụng đụ̀ng dịch chuyờ̉n với các protein. Những tiờ́n bụ̣ gõ̀n đõy trong cụng nghợ̀ đợ̀m đã làm nhẹ bớt vṍn đờ̀ này bằng cách hòa tan protein ở pH tụ́t dưới pKa của cysteine (ví dụ: bis-Tris, pH 6,5) và bao gụ̀m các tác nhõn khử (ví dụ: sodium bisulfite) là yờ́u tụ́ di chuyờ̉n vào gel phía trước các protein đờ̉ duy trì mụ̣t mụi trường khử. Mụ̣t lợi ích nữa của đợ̀m được sử dụng với các pH thṍp là acrylamide gel ụ̉n định hơn vì thờ́ gel có thờ̉ được bảo quản trong mụ̣t thời gian dài trước khi sử dụng.

1.2. Điện di 2D-PAGE

Ngoài điợ̀n di SDS, có thờ̉ điợ̀n di các protein tùy theo điờ̉m đẳng điợ̀n (isoelectric point, IEP) của chúng. Phương pháp này được gọi là điợ̀n di tọ̃p trung đẳng điợ̀n (isoelectric focusing, IEF). Trong dung dịch đợ̀m có pH biờ́n thiờn liờn tục (gradient pH), các protein sẽ phõn ly đờ́n vị trí tương thích với điờ̉m đẳng điợ̀n của mỡnh.

Mụ̣t hụ̃n hợp protein phức tạp được nạp vào ở giữa của mặt trái, ở đó pH là trung tính và mụ̣t điợ̀n áp được sử dụng trờn khuụn gel. Các protein sau đó dịch chuyờ̉n thụng qua gel cho đờ́n khi chúng hướng tới điờ̉m đẳng điợ̀n của mình, là điờ̉m mà ở đó điợ̀n tích của chúng tương tự như pH ở vùng chung quanh. Gel sau đó được ngõm trong dung dịch biờ́n tính (đờ̉ làm cho các protein khụng cuụ̣n xoắn) chứa chṍt tõ̉y là SDS. Phõn tử này tích điợ̀n õm rṍt mạnh và liờn kờ́t với tṍt cả protein, làm cho tṍt cả chúng đờ̀u mang điợ̀n õm. Mụ̣t điợ̀n áp sau đó được sử dụng trờn khuụn gel từ đõ̀u này đờ́n đõ̀u kia đờ̉ tṍt cả protein sẽ chuyờ̉n đụ̣ng hướng tới anode, nhưng những protein nhỏ hơn sẽ chuyờ̉n đụ̣ng qua gel nhanh hơn, vì thờ́ các protein được phõn tách theo kích thước của chúng.

Kỹ thuọ̃t điợ̀n di 2 chiờ̀u (2D-PAGE, 2 dimension polyacryamide gel electrophoesis) được dùng đờ̉ phõn tách hụ̃n hợp protein, và đặc biợ̀t hữu ích cho viợ̀c so sỏnh các mõ̃u liờn quan như mõ̃u mụ bình thường và mõ̃u mụ đụ̣t biờ́n. Comparative 2D-PAGE cũng có thờ̉ được dùng đờ̉ tìm kiờ́m các protein mà sự biờ̉u hiợ̀n của chúng rṍt tương đụ̀ng dưới cùng mụ̣t tọ̃p hợp các điờ̀u kiợ̀n (những yờ́u tụ́ này có các chức năng liờn quan) và nhọ̃n dạng các protein được sản xuṍt trong phản ứng với liợ̀u pháp thuụ́c.

Có khoảng 10.000 protein khác nhau trong tờ́ bào, tọ̃p trung trong hơn sáu loại quan trọng. Kỹ thuọ̃t 2D-PAGE khụng đủ nhạy đờ̉ phát hiợ̀n các protein hiờ́m và nhiờ̀u protein sẽ khụng được phõn giải. Vì thờ́, cõ̀n phải phõn cắt mõ̃u trong các phõ̀n khác nhau đờ̉ làm giảm sự phức tạp của hụ̃n hợp protein trước khi thực hiợ̀n 2D-PAGE.

Hai phương pháp điợ̀n di theo khụ́i lượng phõn tử và điờ̉m đẳng điợ̀n có thờ̉ kờ́t hợp với nhau tạo nờn kỹ thuọ̃t điợ̀n di 2 chiờ̀u.

Hỡnh 3.2. Điện di protein hai chiều

Điợ̀n di protein trờn polyacrylamide gel cho phộp phõn đoạn, xác định khụ́i lượng phõn tử và phõn lọ̃p protein. Ngoài ra, khụ́i lượng protein còn được xác định chính xác bằng phương pháp sắc ký khụ́i phụ̉.