SẢN XUẤT ENZYME TỪ NGUễ̀N THỰC VẬT

- O CH2 COOH phõn ly

2. SẢN XUẤT ENZYME TỪ NGUễ̀N THỰC VẬT

2.1. Các thành tựu sản xuất protein từ thực vật trờn thế giới

Enzyme có nguụ̀n gụ́c thực vọ̃t được sản xuṍt và thương mại hóa đõ̀u tiờn là papain từ nhựa đu đủ.

Chờ́ phõ̉m cụng nghiợ̀p papain được tinh chờ́ và sản xuṍt đõ̀u tiờn ở Chõu Phi, tại Zaire năm 1974. Sản phõ̉m tinh chờ́ có cường lực xúc tác gṍp 2,5 lõ̀n sản phõ̉m thụ. Năm 1980, người ta đã xõy dựng tại Perou mụ̣t nhà máy hiợ̀n đại sản xuṍt enzyme Papain với cụng suṍt khoảng 15 tṍn/năm.

Những năm gõ̀n đõy, thị trường enzyme có nhiờ̀u thay đụ̉i, nhiờ̀u chờ́ phõ̉m enzyme từ nguụ̀n vi sinh vọ̃t được đưa ra với giá rẻ hơn và hoạt lực của enzyme vi sinh vọ̃t cũng mạnh nờn có nhiờ̀u lợi thờ́ hơn. Do đó, viợ̀c sản xuṍt enzyme từ nguụ̀n thực vọ̃t có chiờ̀u hướng đi xuụ́ng.

Papain sản xuṍt cụng nghiợ̀p có khả năng chịu nhiợ̀t cao (55ữ60o

C), trong khoảng pH rụ̣ng từ 5ữ7.

Papain sản xuṍt từ cõy đu đủ nờn rṍt an toàn, khụng đụ̣c hại cho người nờn enzyme này được sử dụng nhiờ̀u trong cụng nghợ̀ thực phõ̉m. Khoảng 75% lượng enzyme sản xuṍt ra được sử dụng trong sản xuṍt bia, 10% sử dụng trong sản xuṍt thịt (làm mờ̀m thịt), 5% sử dụng trong sản xuṍt thức ăn gia súc và 2% sử dụng trong cụng nghiợ̀p dược phõ̉m.

Ngoài Papain ra, enzyme thực vọ̃t còn có Bromelain sản xuṍt từ dứa và Ficin sản xuṍt từ mủ của các cõy họ sung, vả. Tuy nhiờn cỏc enzyme này mức đụ̣ sản xuṍt chưa đạt đờ́n qui mụ cụng nghiợ̀p lớn như Papain.

Ngoài cỏc enzyme thực vọ̃t đã đờ̀ cọ̃p ở trờn, mụ̣t enzyme thực vọ̃t cũng được sản xuṍt và sử dụng với qui mụ cụng nghiợ̀p lớn đó là amylase của đại mạch và các hạt ngũ cụ́c. Điờ̉m khác biợ̀t chủ yờ́u ở loại enzyme này là người ta khụng chiờ́t tách và tinh chờ́ thành chờ́ phõ̉m mà sử dụng chúng đờ̉ thủy phõn tinh bụ̣t có ngay trong hạt nơi chứa enzyme.

Enzyme trong hạt đại mạch hoạt đụ̣ng mạnh trong giai đoạn hạt nảy mõ̀m, vì vọ̃y, người ta sản xuṍt malt bằng cách cho hạt đại mạch nảy mõ̀m và sau đó sṍy khụ. Malt được sử dụng làm nguyờn liợ̀u đờ̉ sản xuṍt bia.

2.2. Thu nhận một số chế phẩm enzyme từ thực vật

2.2.1 Thu nhận Papain (EC 3.4.4.10)

a. Đặc điểm của papain

Papain được tách từ nhựa đu đủ xanh, là mụ̣t enzyme thực vọ̃t được nghiờn cứu kỹ nhṍt. Trong nhựa đu đủ có chứa mụ̣t hụ̃n hợp protease, bao gụ̀m: Papain, chymopapain A (có gụ́c axit amin cuụ́i là axit glutamic), chymopapain B (có gụ́c axit amin cuụ́i là tyrosine), proteinase III, proteinase IV. Trong đó, hàm lượng papain chiờ́m cao nhṍt (95%) và hoạt tính phõn giải protein của papain cao hơn chymopapain nhiờ̀u lõ̀n.

Papain thuụ̣c nhóm Cystein-protease vì trung tõm hoạt đụ̣ng của nó có chứa nhúm −SH của Cystein, nhóm này nằm gõ̀n vòng imidazol của Histidine và nhúm −COOH của axit Aspactic. Sự tụ̉ hợp của các nhóm chức có mặt trong trung tõm hoạt đụ̣ng tạo điờ̀u kiợ̀n cho hoạt đụ̣ng xúc tác của phõn tử enzyme.

Papain đóng vai trò vừa là mụ̣t endoprotease vừa là mụ̣t exoprotease nờn chúng thủy phõn protein thành cỏc polypeptid và các axit amin. Tính đặc hiợ̀u cơ chṍt của

papain rụ̣ng, nó có thờ̉ thủy phõn hõ̀u hờ́t các liờn kờ́t peptid, trừ liờn kờ́t với proline và với axit glutamic có nhóm −COOH tự do.

Cystein và EDTA là những chṍt hoạt hóa papain. Khi có mặt của Cystein nhóm −SH của trung tõm hoạt đụ̣ng được phục hụ̀i. Sự hoạt hóa càng được tăng cường khi có sự hiợ̀n diợ̀n của các chṍt có khả năng liờn kờ́t với ion kim loại có mặt trong nhựa đu đủ như EDTA. Đờ̉ thu được hoạt tính cao nhṍt người ta thường dùng hụ̃n hợp Cystein và EDTA.

Papain bị kìm hãm bởi các chṍt oxy hóa như O2 , ozon, vv ..., đặc biợ̀t, papain rṍt dờ̃ bị mṍt hoạt tính khi có mặt H2O2. Các ion kim loại nặng như Cd, Zn, Cu, Hg, Pb, Fe, vv ... cũng là những tác nhõn ức chờ́ papain, tuy nhiờn, papain lại khá bờ̀n đụ́i với mụ̣t sụ́ dung mụi hữu cơ.

Đụ̣ hoạt đụ̣ng của papain bị suy giảm theo thời gian bảo quản.

Papain là mụ̣t enzyme chịu được nhiợ̀t đụ̣ tương đụ́i cao. Ở dạng nhựa khụ, papain khụng bị biờ́n tính trong 3 giờ ở 100o

C, còn ở dạng dung dịch, papain bị mṍt hoạt tính sau 30 phút ở 82,5oC. Papain tinh sạch có đụ̣ bờ̀n nhiợ̀t thṍp hơn khi còn ở trong nhựa mủ, có lẽ trong mủ nhựa còn có các protein khác có tác dụng bảo vợ̀ nó.

Papain có khả năng hoạt đụ̣ng ở mụ̣t vùng pH tương đụ́i rụ̣ng từ 4,5 đờ́n 8,5, nhưng lại dờ̃ bị biờ́n tính trong mụi trường axit có pH<4,5 và trong mụi trường kiờ̀m mạnh có pH >12.

b. Thu nhận papain

Quá trình thu nhọ̃n enzyme thụng thường phải trải qua 3 giai đoạn chính theo sơ đụ̀ sau:

Hỡnh 4.5. Sơ đồ quỏ trỡnh thu nhận enzyme papain

Khảo sát nguụ̀n nguyờn liệu:Là tìm hiờ̉u xem ở chủng loại đu đủ nào có thờ̉ thu được nhiờ̀u nhựa và trong nhựa có thành phõ̀n enzyme cao. Hiợ̀n nay, bằng con đường cải tạo giụ́ng, người ta đã cho ra đời những giụ́ng đu đủ có nhiờ̀u mủ đờ̉ thu hoạch và chṍt lượng tụ́t như giụ́ng CO-5 của Ấn Đụ̣.

Phát triển nguụ̀n nguyờn liệu: Là tiờ́n hành trụ̀ng trờn mụ̣t diợ̀n tích lớn nhằm mục đích lṍy mủ, với kỹ thuọ̃t trụ̀ng phù hợp đờ̉ đạt năng suṍt cao. Đụ́i với nguụ̀n enzyme thực vọ̃t thì đõy là cụng đoạn cõ̀n đõ̀u tư nhiờ̀u và có rủi ro, vì sự phát triờ̉n của cõy trụ̀ng phụ thuụ̣c vào nhiờ̀u yờ́u tụ́ như thụ̉ nhưỡng, thời tiờ́t, khí họ̃u, chờ́ đụ̣ canh tỏc, vv ...

Thu nhận enzyme: Nhựa đu đủ thường lṍy ở quả khi còn xanh khoảng 10 tuõ̀n tuụ̉i còn ở trờn cõy. Nhựa được thu hoạch bằng cách dùng dao inox có đõ̀u nhọn rạch thành đường dọc theo quả và hứng vào lọ thủy tinh màu. Thời gian thu hoạch tụ́t nhṍt là vào sáng sớm khi mặt trời chưa lờn. Nhựa được bảo quản trong điờ̀u kiợ̀n khụng tiờ́p xúc với khụng khí, với các ion kim loại đờ̉ tránh bị oxy hóa, tụ́t nhṍt là bảo quản trong điờ̀u kiợ̀n lạnh. Nhựa sau thu hoạch được đem sṍy khụ đờ́n đụ̣ õ̉m khoảng 5%.

Nhựa sṍy khụ được coi là chờ́ phõ̉m enzyme thụ, có thờ̉ sử dụng được ngay. Đờ̉ có chờ́ phõ̉m kỹ thuọ̃t hay chờ́ phõ̉m tinh khiờ́t, cõ̀n phải có thờm cụng đoạn làm sạch và tinh chờ́.

Quỏ trỡnh tinh chờ́ trải qua nhiờ̀u cụng đoạn, tùy theo mức đụ̣ tinh sạch mà ta thu

Khảo sát nguụ̀n

chờ́ phõ̉m kỹ thuọ̃t hay chờ́ phõ̉m tinh khiờ́t. Đờ̉ có chờ́ phõ̉m kỹ thuọ̃t cõ̀n loại bỏ mụ̣t sụ́ tạp chṍt như protein khụng phải enzyme, chṍt bộo, vv ... Nhựa đu đủ khụ được hòa tan theo qui trình sau: trụ̣n 180 g nhựa đu đủ khụ với 100 g celite và 150 gam cát sạch, nghiờ̀n kỹ với 200ữ300 ml dung dịch Cystein 0,04M, pH = 5,7. Khi dịch nhựa tạo thành thờ̉ huyờ̀n phù, gạn bỏ lớp nụ̉i ở trờn - quá trình nghiờ̀n và trích ly được lặp lại với 300 ml dung dịch Cystein. Dịch thu nhọ̃n sau đó được lọc: dịch lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, trong đó có chứa enzyme. Sau đó, dịch lọc được điờ̀u chỉnh pH đờ́n 9 với NaOH 1M. Tủa xám tạo thành được loại bỏ bằng ly tõm hoặc bằng lọc. Dịch trong đem cụ đặc hoặc sṍy khụ sẽ thu dạng chờ́ phõ̉m kỹ thuọ̃t. Đờ̉ thu chờ́ phõ̉m tinh cõ̀n tinh sạch thờm bằng cách kờ́t tủa phõn đoạn với (NH4)2SO4 và tinh sạch bằng các phương pháp sắc ký.

2.2.2. Thu nhận enzyme bromelain từ dứa

a. Đặc điểm của enzyme bromelain

Bromelain là enzyme cú nhiờ̀u trong dứa, được phát hiợ̀n từ giữa thờ́ kỷ 19 nhưng mới được nghiờn cứu từ giữa thờ́ kỉ 20. Bromelain có trong toàn bụ̣ cõy dứa (thõn, quả, lá,…) nhưng tọ̃p trung nhiờ̀u trong lừi quả dứa.

Bromelain là enzyme thủy phõn protein, có tác dụng tụ́t cho tiờu hóa, hoạt đụ̣ng được trong mụi trường axit của dạ dày và mụi trường kiờ̀m của ruụ̣t non. Nó có thờ̉ thay thờ́ cho các enzyme tiờu hóa như pepsin, trysin.

Bromelain có trọng lượng phõn tử lớn gṍp 1,5 lõ̀n so với papain, là mụ̣t glycoprotein, trong thành phõ̀n cṍu tạo có chứa các gụ́c đường (maltose, glucosamin, fructose). Trung tõm hoạt đụ̣ng có chứa cystein và sợi polypeptid liờn kờ́t với nhau bằng cõ̀u nụ́i – S – S – . Nhúm -SH có vai trò chủ yờ́u trong hoạt đụ̣ng xúc tác thủy phõn protein. Bromelain thuụ̣c nhóm cystein protease.

Phõn tử bromelain có dạng hình cõ̀u.Bromelain của thõn dứa có thành phõ̀n axit amin trong khoảng 144 - 321 và bromelain của quả có thành phõ̀n axit amin trong khoảng 161 - 283 gụ́c axit amin. Bromelain có 3 hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase, hoạt tính esterase ở bromelain mạnh hơn papain và ficin.

Bromelain được chiờ́t tách từ các phõn đoạn khác nhau trờn cõy dứa và từ cỏc nguụ̀n khác nhau sẽ có hoạt đụ̣ng sinh lý khác nhau, nhưng hoạt tính thủy phõn protein thì giụ́ng nhau. Bromelain tan nhẹ trong nước và glyxerin, nhưng khụng tan trong dung mụi hữu cơ. Trung tõm hoạt đụ̣ng của bromelain có chứa nhóm – SH nờn dờ̃ dàng bị ức chờ́ bởi chṍt oxy hóa như H2O2, metyl bromua, muụ́i HgCl, ion kim loại… và được hoạt hóa bởi chṍt khử (cystein, sulfit, bisulfit, cyanit,…).

Bromelain có hoạt tính xúc tác phõn giải protein tương tự papain trong mủ đu đủ hay ficin trong cõy thuụ̣c họ sung, nhưng khả năng xúc tác phụ thuụ̣c vào loại cơ chṍt. Nờ́u cơ chṍt là hemoglobin thì khả năng phõn giải của bromelain mạnh hơn papain gṍp 4 lõ̀n, còn cơ chṍt là casein thì khả năng phõn giải của hai enzyme này tương đương nhau. Đụ́i với các cơ chṍt tụ̉ng hợp như Benzoyl-L-Arginine Amide (BAA), Benzoyl- L-Arginine Ethyl Ester (BAEE) thì khả năng phõn giải của bromelain yờ́u hơn papain.

Bromelain có nhiờ̀u tác dụng trong y học và trong chờ́ biờ́n thực phõ̉m.

Trong y học, bromelain được sử dụng đờ̉ làm giảm đau nhanh sau khi phõ̃u thuọ̃t, giảm đau đụ́i với các trường hợp viờm khớp, viờm đa khớp, chụ́ng đụng tụ các tiờ̉u cõ̀u, làm giảm nguy cơ đụ̣t quỵ đụ́i với bợ̀nh tim mạch, tăng khả năng hṍp thụ các loại thuụ́c đặc biợ̀t là kháng sinh như amoxciline hay tetracyline.

Trong cụng nghiợ̀p thực phõ̉m, bromelain được sử dụng đờ̉ làm mờ̀m thịt, thủy phõn gan bũ, làm trong bia, thủy phõn gluten trong sản xuṍt bánh mỳ, làm tăng hương và chṍt lượng bánh.

b. Thu nhận bromelain

Nguyờn liợ̀u có thờ̉ sử dụng đờ̉ thu nhọ̃n bromelain có thờ̉ là thõn dứa, thịt quả dứa và chụ̀i quả dứa. Hoạt tính của enzyme thu nhọ̃n phụ thuụ̣c vào trạng thái và điờ̀u kiợ̀n bảo quản của nguyờn liợ̀u ban đõ̀u.

Theo kờ́t quả nghiờn cứu của Nguyờ̃n Trọng Cõ̉n thì nguyờn liợ̀u tươi mặc dù được bảo quản ở 4oC nhưng hoạt tính bị giảm đi gõ̀n 50%, còn nguyờn liợ̀u sṍy khụ ở 40 oC thì có thờ̉ bảo quản lõu mà hoạt lực khụng giảm. Thu nhọ̃n bromelain từ chụ̀i dứa cú thờ̉ thực hiợ̀n theo sơ đụ̀ hình 4.6.

Mụ̣t sụ́ điờ̉m cõ̀n lưu ý trong qui trình thu nhọ̃n:

- Chụ̀i dứa: chụ̀i dứa là phõ̀n phờ́ liợ̀u nờn sử dụng đờ̉ sản xuṍt sẽ góp phõ̀n giảm giá thành sản phõ̉m. Chụ̀i dứa nờn bỏ bớt phõ̀n lá bao quanh đờ̉ dờ̃ xay (nghiờ̀n) và tăng hiợ̀u quả chiờ́t tách enzyme. Trong quá trình xay nờn bụ̉ sung thờm dung dịch đợ̀m phosphat hoặc dung dịch muụ́i sulphat amon loãng đờ̉ tăng đụ̣ hòa tan của enzyme. Sau khi lọc ộp, dịch lọc thu được đem ly tõm ở 6000 vòng /phút trong 10 phút đờ̉ loại bỏ chṍt xơ và thu dịch ly tõm đem kờ́t tủa.

Hỡnh 4.6. Qui trỡnh thu nhận bromelain từ đầu dứa

- Kờ́t tủa enzyme: đờ̉ kờ́t tủa enzyme người ta có thờ̉ sử dụng nhiờ̀u tác nhõn khác nhau như axeton, ethanol, (NH4)2SO4 ở nụ̀ng đụ̣ cao. Hiợ̀u suṍt thu hụ̀i và chṍt lượng của sản phõ̉m enzyme phụ thuụ̣c vào các yờ́u tụ́ như: Nụ̀ng đụ̣ muụ́i sulphat amon, nhiợ̀t đọ kờ́t tủa, pH dung dịch, thời gian kờ́t tủa.

Kờ́t tủa bằng ethanol 96o: khi kờ́t tủa bằng ethanol cõ̀n thực hiợ̀n trong điờ̀u kiợ̀n lạnh (4o

C). Làm lạnh dung dịch enzyme và ethanol trước khi phụ́i trụ̣n. Tỉ lợ̀ dich enzyme / ethanol thường sử dụng là 1/3. Đờ̉ yờn ở nhiợ̀t đụ̣ lạnh (0 - 4oC) trong thời gian 2- 3 giờ, sau đó ly tõm đờ̉ tách tủa

Kờ́t tủa bằng axeton: khi kờ́t tủa bằng axeton cũng cõ̀n thực hiợ̀n trong điờ̀u kiợ̀n nhiợ̀t đụ̣ thṍp như trường hợp với ethanol, tuy nhiờn cõ̀n lưu ý, khụng nờn đờ̉ ngõm enzyme quá lõu trong dung mụi vì chúng sẽ có tác dụng xṍu đờ́n enzyme. Thời gian đờ̉ yờn sau khi bụ̉ sung dung mụi khoảng 1 giờ, sau đó ly tõm tách tủa.

Xay (nghiền) Lọc ộp Ly tõm dịch lọc

Sấy khụ (ở 40 o