GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIấ́P PROTEIN

- O CH2 COOH phõn ly

3. GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIấ́P PROTEIN

Mặc dù có cṍu tạo phức tạp hơn so với ADN và ARN, các phõn tử protein cũng có thờ̉ giải trình tự trực tiờ́p, tức là viợ̀c xác định thành phõ̀n và thứ tự của các acid amin trờn chuụ̃i polypeptid. Có hai phương pháp được sử dụng phụ̉ biờ́n hơn cả là:

1- Phương pháp biờ́n tính dman 2- Phương pháp khụ́i phụ̉ kờ́ tiờ́p.

Khả năng xác định được trình tự protein có ý nghĩa quan trong trong trong nhiờ̀u nghiờn cứu vờ̀ hợ̀ protein học (proteomics) và hợ̀ gen học (genomics). Bởi vì với viợ̀c xác định được dù chỉ là mụ̣t trình tự ngắn của các acid amin của mụ̣t phõn tử protein nào đó, chúng ta có thờ̉ xác định được gen mã hóa cho protein đó trờn cơ sở đụ́i chiờ́u với khung đọc mở có trong hợ̀ gen của nhiờ̀u loài vụ́n đã được giải mã hoàn toàn hoặc gõ̀n như hoàn toàn nhưng nhưng chưa biờ́t đõ̀y đủ vờ̀ chức năng của nhiờ̀u gen.

3.1. Phương pháp biến tớnh dman

Phương pháp biờ́n tính dman là mụ̣t phản ứng hóa học trong đó các tiờ̉u phõ̀n acid amin được giải phóng lõ̀n lượt từ đõ̀u N của chuụ̃i polypeptid. Điờ̉m mṍu chụ́t của phương pháp này là acid amin ở tọ̃n cùng đõ̀u N của mụ̣t chuụ̃i polypeptid có thờ̉ được cải biờ́n khi xử lý với phenylisothyocyanate (PTC) dõ̃n đờ́n sự thay đụ̉i ở gụ́c a-amino. Acid amin được cải biờ́n này sau đó được cắt rời khỏi chuụ̃i polypeptid khi xử lý với acid trong điờ̀u kiợ̀n khụng làm phá hủy phõ̀n còn lại của chuụ̃i polypeptid. Viợ̀c xác định trình tự các acid amin được tiờ́n hành dựa trờn thứ tự hụ̀i lưu của từng acid amin được cắt khỏi chuụ̃i bằng kỹ thuọ̃t sắc ký lỏng hiợ̀u năng cao HPLC (high performance liquid chromatography), nhờ đặc điờ̉m từng loại acid amin có thời gian hụ̀i lưu đặc trưng. Mụ̃i mụ̣t vòng gõy biờ́n đụ̉i acid amin và cắt khỏi chuụ̃i polypeptid như vọ̃y tạo ra mụ̣t chuụ̃i polypeptid và mụ̣t nhóm a-amino. Với viợ̀c lặp đi, lặp lại phản ứng cắt acid amin này sẽ cho phộp xác định được trình tự ở đõ̀u N của mụ̣t chuụ̃i polypeptid.

Trong thực tờ́, chu kỳ gõy biờ́n tính như vọ̃y được lặp đi lặp lại từ 8 – 15 lõ̀n đờ̉ xác định protein . Sụ́ chu kỳ như vọ̃y thụng thường là đủ đờ̉ xác định được mụ̣t loại protein đặc thù nào đó.

3.2. Phương pháp giải mó trình tự tự động dựa trờn nguyờn lý biến tớnh dman :

Đõy là mụ̣t phương pháp hiợ̀u quả và cũng đã được sử dụng rụ̣ng rãi. Tuy vọ̃y kỹ thuọ̃t này gặp trở ngại khi đõ̀u N tọ̃n cùng của phõn tử protein bị cải biờ́n vờ̀ mặt hóa học (ví dụ như bởi các nhóm acetyl hoặc formyl), mà hiợ̀n tượng này thì vụ́n có thờ̉ xảy ra tự nhiờn trong điờ̀u kiợ̀n invivo, hoặc trong quá trình tách chiờ́t và tinh sạch protein. Đờ̉ khắc phục hiợ̀n tượng này , người ta có thờ̉ sử dụng protease đờ̉ cắt chuụ̉i polypeptid và phõn tích trình tự bờn trong chuụ̉i.

3.3. Phương pháp khối phổ kế tiếp (MS/MS)

Phương pháp này có thờ̉ được dùng đờ̉ xác định các vùng trình tự protein khác nhau. Khụ́i phụ̉ là phương pháp xác định chính xác khụ́i lượng của các các phõn tử nhỏ. Mụ̣t cách vắn tắt phương pháp này được mụ tả như sau: phõn tử cõ̀n phõn tích được cho bay qua mụ̣t thiờ́t bị (trong điờ̀u kiợ̀n chõn khụng) trong điờ̀u kiợ̀n tụ́c đụ̣ di chuyờ̉n của nó tương quan với tỉ sụ́ khụ́i lượng / điợ̀n tích. Trờn cơ sở này người ta có thờ̉ đo được thời gian bay của phõn tử và xác định được khụ́i lượng của nó . Đụ́i với các phõn tử sinh học có kích thước nhỏ như các chuụ̃i peptid và các phõn tử protein nhỏ, thì trọng lượng phõn tử của nó có thờ̉ xác định chính xác đờ́n từng Dalton.

Đờ̉ xác định khụ́i lượng phõn tử protein bằng phương pháp MS /MS, trước tiờn phõn tử protein thường được cắt thành các đoạn peptid có trình tự ngắn (thường dưới 20 acid amin) nhờ sử dụng enzyme đặc hiợ̀u, chẳng hạn như trypsin. Hụ̃n hợp các đoạn peptid này sau đó được đưa vào phõn tích khụ́i phụ̉ và chúng phõn tách nhau ra dựa trờn tỉ sụ́ khụ́i lượng / điợ̀n tích. Các đoạn peptid riờng rẽ sau đó sẽ bị bắt giữ và phõn đoạn thành các chuụ̃i peptid thành phõ̀n. Khụ́i lượng của mụ̃i peptid thành phõ̀n được xác định bằng phụ̉ khụ́i như minh họa trờn hình 3.4. Sự kờ́t hợp các dữ liợ̀u vờ̀ khụ́i lượng của các đoạn peptid thành phõ̀n sẽ cho biờ́t trình tự rừ ràng của phõn tử protein ban đõ̀u. Cũng giụ́ng như trong phương pháp biờ́n tính dman, viợ̀c xác định được trình

tự của của khoảng 15 acid amin là đủ đờ̉ so sánh với trình tự protein được luọ̃n ra từ các trình tự ADN đã được giải mã.

Hỡnh 3.4. Phõn tớch hệ protein học (proteomics) bằng điện di hai chiều và khối phổ. a. Cỏc protein được tỏch chiết từ tế bào vả phõn lập bằng điện di hai chiều , một chiều dựa trờn nguyờn tắc hội tụ đẳng điện , một chiều do sự khỏc biệt về khối lượng phõn tử protein sau khi gõy biến tớnh bằng SDS trờn gel polyacrylamid (SDS-PAGE).

b. Cỏc protein riờng biệt tương ứng với từng điểm trờn bản điện di được phõn tỏch, xử lý cắt bằng enzyme trypsin và đưa đi phõn tớch khối phổ.

c. Phổ khối cho thấy từng peptid được phõn tỏch tiờng rẽ do sự khỏc biệt về tỉ lệ (khối lượng/điện tớch) của chỳng qua đú.

Kỹ thuọ̃t MS /MS thực sự là mụ̣t kỹ thuọ̃t có tính cách mạng trong viợ̀c xác định và giải trình tự protein. Trong phương pháp này, thụng thường chỉ cõ̀n mụ̣t lượng mõ̃u nhỏ và có thờ̉ phõn tích hụ̃n hợp nhiờ̀u loại protein đụ̀ng thời