Phương phỏp sắc kớ ỏi lực (affinity chromatography)

- O CH2 COOH phõn ly

3.2.5 Phương phỏp sắc kớ ỏi lực (affinity chromatography)

Cơ sở của phương pháp này là người ta gắn những phõn tử (chṍt) vào chṍt mang (chṍt giá) rắn bằng liờn kờ́t cụ̣ng hóa trị mà protein enzyme cõ̀n tách sẽ tương tác đặc hiợ̀u với nó. Những chṍt đó có thờ̉ là cơ chṍt (Substrate) hoặc chṍt ức chờ́ (inhibitor) cạnh tranh. Hay nói cách khác dùng chṍt chỉ có khả năng liờn kờ́t đặc hiợ̀u với mụ̣t enzyme hoặc protein mà người ta nghiờn cứu.

Chṍt mang thờ̉ rắn có thờ̉ là bṍt kỳ mụ̣t loại nào phục vụ cho lọc gel như sephadex, nhưng người ta hay sử dụng nhṍt là gel sepharose.

Ở trờn cụ̣t chứa cơ chṍt cụ́ định ở pH và lực ion phù hợp, chỉ có enzyme nào cú khả năng chuyờ̉n hóa cơ chṍt mới gắn vào, các protein khác thì chảy xuụ́ng cụ̣t. Bằng cách thay đụ̉i pH và lực ion phù hợp hoặc có thờ̉ bằng cách thờm cơ chṍt đã được hòa tan vào thì có thờ̉ tách được enzyme khỏi cụ̣t ở trạng thái sạch.

Sắc ký ái lực là phương pháp được ứng dụng theo quy mụ cụng nghiợ̀p , bắt đõ̀u ứng dụng vào năm 1960. Thời gian đõ̀u người ta thường sử dụng Gelshephadex -G25 và phương pháp tách bằng trao đụ̉i ion với DEAE-sephadex A.50.

Trong những năm gõ̀n đõy , nhờ tiờ́n bụ̣ của viợ̀c chờ́ tạo má y móc và thiờ́t bị , nhiờ̀u cụng ty đã áp dụng nhiờ̀u phương pháp khác nhau trong quá trình sản xuṍt vời quy mụ cụng nghiợ̀p . Các cụ̣t sắc ký có thờ̉ được chờ́ tạo bằng thủy tinh , bằng plastic hoặc bằng thộp khụng rỉ . Trong thời gian gõ̀n đõy, người ta thường chờ́ tạo các cụ̣t sắc ký bằng thộp khụng rỉ vì có thờ̉ sử dụng được lõu , khụng bị vỡ như bằng thủy tinh và khụng bị lão hóa như bằng plastic.

Mụ̣t dạng rṍt phụ̉ biờ́n của sắc ký ái lực là sắc ký ái lực miờ̃n dịch. Trong phương pháp này, người ta gắn kháng thờ̉ đặc hiợ̀u với protein đích lờn vọ̃t liợ̀u làm cụ̣t sắc ký. Trong trường hợp lý tưởng, loại kháng thờ̉ này chỉ liờn kờ́t đúng với loại protein cõ̀n quan tõm còn cho phộp tṍt cả các loại protein khác chảy trụi qua cụ̣t. Loại protein liờn kờ́t sau đó sẽ được thu hụ̀i (hụ̀i lưu) bằng cách sử dụng dung dịch muụ́i hoặc đụi khi là các dung dịch chṍt tõ̉y nhẹ chảy qua cụ̣t. Khó khăn cơ bản gặp phải đụ́i với phương pháp này là đụi khi liờn kờ́t giữa kháng thờ̉ và protein khá bờ̀n vững đờ́n mức phải gõy biờ́n tính protein mới thu hụ̀i được sản phõ̉m. Trong khi khác với ADN, protein sau khi biờ́n tính thường khụng có khả năng hụ̀i tính, vì vọ̃y protein thu được theo cách này nhiờ̀u khi ở dạng khụng hoạt đụ̣ng chức năng và mṍt đi giá trị sử dụng trong nghiờn cứu.

Đờ̉ tăng hiợ̀u quả tinh sạch, các protein cũng có thờ̉ được cải biờ́n. Những cải biờ́n này có thờ̉ là sự bụ̉ sung các trình tự acid amin ngắn hoặc là vào đõ̀u C hoặc vào đõ̀u N của phõn tử protein cõ̀n phõn tích. Những bụ̉ sung này, hay còn gọi là Ptrình tự đánh dṍu có thờ̉ tạo ra được bằng cụng nghợ̀ ADN tái tụ̉ hợp. Các trình tự peptid đánh dṍu giúp thay đụ̉i thuụ̣c tính của mụ̣t phõn tử protein mong muụ́n và giúp tinh chờ́ protein này dờ̃ dàng hơn. Ví dụ như, đụ́i với mụ̣t sụ́ protein người ta tiờ́n hành bụ̉ sung mụ̣t chuụ̃i gụ̀m 6 histidin giúp những protein này liờn kờ́t với Ni2+ gắn trờn cụ̣t chặt hơn và dờ̃ phõn tách hơn, trong khi thuụ̣c tính này thường khụng có ở phõ̀n lớn các loại protein khác. Ngoài ra viợ̀c sử dụng các epitop đặc hiợ̀u (thường là mụ̣t trình tự peptid cú 5 ữ 7 acid amin đặc hiợ̀u xác định kháng nguyờn) cũng có thờ̉ được gắn vào phõn tử protein cõ̀n tinh chờ́. Các cải biờ́n này cho phộp tinh sạch các loại protein trờn cơ sở nguyờn tắc sắc ký ái lực miờ̃n dịch và sử dụng dị kháng nguyờn mang các epitop được bụ̉ sung. Điờ̀u đặc biợ̀t là, các kháng thờ̉ và epitop này có thờ̉ thay đụ̉i tính liờn kờ́t kháng thờ̉ tùy thuụ̣c vào điờ̀u kiợ̀n khác nhau của mụi trường (chẳng hạn, ái lực tăng khi khụng cú Ca2+, và ái lực giảm khi cú Ca2+). Điờ̀u này cũng giúp làm giảm ảnh hưởng của các yờ́u tụ́ gõy biờ́n tính khác.

Nguyờn tắc sắc ký ái lực miờ̃n dịch cũng có thờ̉ được dùng đờ̉ làm kờ́t tủa nhanh mụ̣t loại protein đặc hiợ̀u nào đó (và mọi loại protein liờn kờ́t chặt với nó) từ mụ̣t dịch chiờ́t thụ. Trong trường hợp này, phản ứng kờ́t tủa thu được do kháng thờ̉ được gắn vào cùng loại hạt được sử dụng trong sắc ký cụ̣t. Do các hạt này có kích thước lớn, nờn chúng lắng rṍt nhanh xuụ́ng đáy ụ́ng nghiợ̀m mang theo các kháng thờ̉ và protein liờn kờ́t với chúng. Kỹthuọ̃t này được gọi là kỹ thuọ̃t kờ́t tủa miờ̃n dịch, cũng là mụ̣t kỹ thuọ̃t ngày càng sử dụng phụ̉ biờ́n đờ̉ tinh sạch nhanh protein hoặc phức hợ̀ protein từ các dịch chiờ́t thụ. Mặc dù nờ́u chỉ sử dụng phương pháp này riờng rẽ, hiờ́m khi thu được sản phõ̉m protein được tinh sạch hoàn toàn, song phương pháp này thường rṍt hiợ̀u quả đờ̉ xác định các loại phõn tử protein và các hợp chṍt khác (ví dụ như ADN) có tương tác với mụ̣t loại protein đích nào đó.