- O CH2 COOH phõn ly
3. Enzyme nấm men
Invectase 3.2.1.25 Saccharomyces Nụ̣i/ngoại Mứt kẹo Lactase 3.2.1.23 Kluyveromyces Nụ̣i/ngoại Sữa
Lipase 3.1.1.3 Candida Ngoại bào Thực phõ̉m Raffinase 3.2.1.11 Saccharomyces Nụ̣i bào Thực phõ̉m
Hợ̀ enzyme của vi sinh vọ̃t có thờ̉ thay đụ̉i, đờ̉ điờ̀u khiờ̉n sự tụ̉ng hợp enzyme ở vi sinh vọ̃t người ta có thờ̉ sử dụng các cách sau:
- Tác đụ̣ng vào bụ̣ gen bằng cách gõy đụ̣t biờ́n hoặc cài thờm gen mới.
- Đưa chṍt cảm ứng (cơ chṍt đặc hiợ̀u) vào mụi trường nuụi cṍy, kích thích sự tụ̉ng hợp enzyme. Đõy là cách điờ̀u khiờ̉n thường được sử dụng đụ́i với các enzyme dị hóa, tuy nhiờn đờ̉ đạt được kờ́t quả, cõ̀n phải nắm vững vờ̀ sinh lý của vi sinh vọ̃t. Sự tụ̉ng hợp enzyme trong tờ́ bào chỉ được thực hiợ̀n khi có nhu cõ̀u, vì vọ̃y, người điờ̀u khiờ̉n khụng chỉ nắm rừ cơ chṍt nào cõ̀n đưa vào mụi trường mà còn phải biờ́t đưa vào thời điờ̉m nào, với sụ́ lượng bao nhiờu cho phù hợp.
- Điờ̀u khiờ̉n theo cơ chờ́ ức chờ́ ngược bỡi sản phõ̉m cuụ́i. Đõy là cơ chờ́ điờ̀u khiờ̉n sự tụ̉ng hợp protein và các chṍt trong tờ́ bào, theo cơ chờ́ điờ̀u khiờ̉n này thì khi sản phõ̉m cuụ́i tạo ra nhiờ̀u, sẽ có tác dụng ức chờ́ ngược đờ́n quá trình tụ̉ng hợp ra nó,
vì vọ̃y lượng sản phõ̉m cuụ́i sẽ khụng thờ̉ tăng lờn quá mụ̣t giới hạn nhṍt định. Nờ́u sản phõ̉m cuụ́i là mụ̣t enzyme mà mình muụ́n thu nhọ̃n, thì phải tìm cách tách nó ra khỏi quá trình hoặc tìm cách chuyờ̉n hóa sang mụ̣t dạng khác thì quá trình tụ̉ng hợp ra enzyme đó mới được duy trì. Ngược lại, nờ́u muụ́n enzyme đó khụng được tụ̉ng hợp thì tìm cách gia tăng lờn đờ̉ ức chờ́ ngược.
1.2. Qui trình sản xuất enzyme từ vi sinh vật
Qui trình sản xuṍt chờ́ phõ̉m enzyme từ vi sinh vọ̃t bao gụ̀m các giai đoạn sau: - Phõn lọ̃p, tuyờ̉n chọn và cải tạo giụ́ng vi sinh vọ̃t
- Nuụi cṍy vi sinh vọ̃t đờ̉ thu enzyme - Tách và tinh chờ́ enzyme
1.2.1. Phõn lập, tuyờ̉n chọn và cải tạo giống vi sinh vật
Vi sinh vọ̃t có mặt ở mọi nơi: trong đṍt, trong nước, trong khụng khí. Hợ̀ enzyme của các vi sinh vọ̃t khác nhau là khụng giụ́ng nhau, vì vọ̃y đờ̉ sản xuṍt mụ̣t loại enzyme nào đó, thụng thường, người ta tìm kiờ́m chủng vi sinh vọ̃t có khả năng tụ̉ng hợp enzyme đó cao từ mụi trường bằng cách phõn lọ̃p và sau đó tuyờ̉n chọn, hoặc lṍy từ bụ̣ sưu tọ̃p giụ́ng có sẵn đã được tuyờ̉n chọn.
Trong tự nhiờn, các vi sinh vọ̃t có khả năng tụ̉ng hợp mụ̣t enzyme nào đó cao thường là do chúng sụ́ng trờn vùng có giàu cơ chṍt đó vì vọ̃y nờn nờ́u ta muụ́n phõn lọ̃p vi sinh vọ̃t có khả năng tụ̉ng hợp enzyme protease cao thì phải tìm nơi có chứa nhiờ̀u protein, hay nờ́u muụ́n phõn lọ̃p vi sinh vọ̃t có chứa enzyme amylase cao phải tìm nơi có nhiờ̀u tinh bụ̣t, vv...Thụng thường, các vi sinh vọ̃t tự nhiờn chỉ có khả năng sinh enzyme đờ́n mụ̣t giới hạn nhṍt định, phụ thuụ̣c vào hoạt đụ̣ng của bụ̣ gen của chúng. Đờ̉ có mụ̣t chủng vi sinh vọ̃t có thờ̉ sinh enzyme đặc biợ̀t cao cõ̀n phải cải tạo giụ́ng. Phương pháp cải tạo giụ́ng hiợ̀u quả hiợ̀n nay là tác đụ̣ng vào bụ̣ gen bằng cách gõy đụ̣t biờ́n và bằng kỹ thuọ̃t gen.
Gõy đụ̣t biờ́n bằng các tác nhõn vọ̃t lý như tia cực tím, tia X (rơnghen), tia γ, hoặc bắn phá bằng các hạt electron, nơtron.., bằng tác nhõn hóa học như nitrometylguanidin, etylmetylsulfonat, ...
Cải tạo giụ́ng bằng kỹ thuọ̃t gen là tác đụ̣ng vào bụ̣ gen bằng cách đưa thờm gen mới vào (tái tụ̉ hợp gen) hoặc tác đụ̣ng đờ̉ làm mṍt sự kiờ̉m soát cơ chờ́ tụ̉ng hợp dõ̃n đờ́n tụ̉ng hợp thừa enzyme mỡnh quan tõm. Cải tạo giụ́ng bằng kỹ thuọ̃t gen vừa nhanh vừa hiợ̀u quả.
Trong cụng nghợ̀ enzyme, giụ́ng quyờ́t định những vṍn đờ̀ quan trọng sau:
- Hiợ̀u suṍt thu nhọ̃n sản phõ̉m. Giụ́ng có khả năng tụ̉ng hợp enzyme càng cao thỡ hiợ̀u quả thu nhọ̃n càng lớn.
- Cường lực xúc tác của enzyme.
- Giá thành của sản phõ̉m và vụ́n đõ̀u tư xõy dựng nhà máy.
Bằng những kỹ thuọ̃t nõng cao chṍt lượng giụ́ng, người ta đã tạo ra những giụ́ng có khả năng sinh tụ̉ng hợp enzyme rṍt cao và được sử dụng trong sản xuṍt enzyme ở qui mụ cụng nghiợ̀p, tạo ra chờ́ phõ̉m enzyme có chṍt lượng cao và giá thành thṍp.
1.2.2. Nuụi cấy vi sinh vật đờ̉ thu enzyme
Có hai phương pháp nuụi cṍy vi sinh vọ̃t đờ̉ thu chờ́ phõ̉m enzyme là nuụi trờn mụi trường rắn (nuụi cṍy bờ̀ mặt) và nuụi trong mụi trường lỏng (nuụi cṍy chìm).
Dù nuụi cṍy theo phương pháp bờ̀ mặt hay phương pháp chìm thì vṍn đờ̀ đõ̀u tiờn là phải chọn mụi trường nuụi phù hợp cho mục đích sản xuṍt.
1-Thành phần dinh dưỡng của mụi trường
Thành phõ̀n dinh dưỡng của mụi trường nuụi có tính đặc thù cho mụ̃i loại vi sinh vọ̃t, ngay cả trong trường hợp mụ̣t loại vi sinh vọ̃t nhưng mụi trường nuụi đờ̉ sinh enzyme này hay enzyme khác là cũng khụng giụ́ng nhau. Nhưng nhìn chung trong mụi trường dinh dưỡng phải có các thành phõ̀n chính sau:
Nguụ̀n nitơ: Nguụ̀n nitơ có thờ̉ ở dạng nitơ vụ cơ hoặc nitơ hữu cơ. Nitơ vụ cơ
như các muụ́i (NH4)2SO4 , NaNO3 , (NH4)NO3 ... Nitơ hữu cơ như pepton, cao thịt, bụ̣t cá, cao nṍm men, ... Khi sử dụng các muụ́i vụ cơ, cõ̀n lưu ý là chúng sẽ có ảnh hưởng đờ́n pH của mụi trường. Nờ́u sử dụng các muụ́i amoni thỡ sau mụ̣t thời gian, cỏc vi sinh vọ̃t hṍp thụ ion NH4
+
, cũn cỏc anion là cỏc gụ́c axit (SO4
-2) sẽ làm pH mụi trường giảm, mụi trường bị axit hóa, ngược lại, nờ́u sử dụng các muụ́i nitrat thì vi sinh vọ̃t hṍp thụ nguụ̀n nitơ là nhóm (NO3-1), còn lại ion kim loại tự do sẽ làm kiờ̀m hóa mụi trường. Vì vọ̃y, viợ̀c chọn nguụ̀n nitơ thích hợp cho vi sinh vọ̃t tụ̉ng hợp mụ̣t enzyme mà mình quan tõm là viợ̀c hờ́t sức quan trọng. Nguụ̀n nitơ sử dụng đờ̉ tụ̉ng hợp các hợp chṍt chứa nitơ của cơ thờ̉ sụ́ng là protein, axit nucleic, axit amin, ...
Nguụ̀n carbon: Nguụ̀n carbon chủ yờ́u là các loại đường dờ̃ hṍp thụ như glucose,
maltose, rỉ đường mía, rỉ đường củ cải, mọ̃t tinh bụ̣t, vv... hoặc các loại polysacchsrid như tinh bụ̣t, cellulose, vv... Nguụ̀n carbon chính là nguụ̀n gluxit cung cṍp cho vṍn đờ̀ sinh năng lượng cho hoạt đụ̣ng sụ́ng.
Muối khoáng và vitamin: Muụ́i khoáng và vitamin hờ́t sức cõ̀n thiờ́t cho vi sinh
vọ̃t sinh trưởng và phát triờ̉n vì vọ̃y cõ̀n phải có đủ nhu cõ̀u cõ̀n thiờ́t.
Ngoài các thành phõ̀n chính như đã đờ̀ cọ̃p ở trờn, đờ̉ vi sinh vọ̃t sinh sản và phát triờ̉n, người ta cũn đưa thờm vào mụi trường các cơ chṍt, các chṍt kích thích nhằm định hướng cho sự tụ̉ng hợp loại enzyme mà mình cõ̀n.
2-Nuụi trờn mụi trường rắn (phương phỏp bờ̀ mặt)
Nguời ta sử dụng mụi trường rắn có đụ̣ õ̉m thích hợp đờ̉ nuụi vi sinh vọ̃t. Vi sinh vọ̃t phát triờ̉n trờn bờ̀ mặt của các hạt mụi trường dinh dưỡng. Loại mụi trường này người ta thường dùng các nguyờn liợ̀u tự nhiờn như cám gạo, trṍu, ngụ, sắn, vv..., cú thờ̉ bụ̉ sung thờm nguụ̀n dinh dưỡng khác đờ̉ đảm bảo sự phát triờ̉n và tụ̉ng hợp enzyme. Tùy theo từng loại vi sinh vọ̃t và mục đích thu enzyme, người ta có thờ̉ bụ̉ sung thờm nguụ̀n nitơ vụ cơ như muụ́i sulphat amon, nitrat natri, urờ hoặc nguụ̀n nitơ hữu cơ như cao nṍm men, cao ngụ, dịch chiờ́t malt, vv... Những loài vi sinh vọ̃t hiờ́u khí như nṍm sợi, mụ́c thường nuụi trờn mụi trường rắn. Mụi trường phải được làm õ̉m (50ữ60%) và tiợ̀t trùng trước khi cṍy vi sinh vọ̃t vào. Người ta thường trải mụi trường trờn bờ̀ mặt rụ̣ng (các khay rụ̣ng) rụ̀i cṍy vi sinh vọ̃t vào. Phải thiờ́t kờ́ có phòng nuụi chuyờn dụng, đảm bảo giảm tụ́i đa sự lõy nhiờ̃m các vi sinh vọ̃t từ bờn ngoài và đảm bảo giữ đụ̣ õ̉m thích hợp cho sự phát triờ̉n của vi sinh vọ̃t.
Nuụi cṍy bờ̀ mặt có mụ̣t sụ́ ưu điờ̉m sau:
- Nụ̀ng đụ̣ enzyme thu nhọ̃n cao hơn phương pháp nuụi trong mụi trường lỏng. - Khụng bị nhiờ̃m trùng toàn bụ̣, những chụ̃ mụi trường bị nhiờ̃m trùng có thờ̉ loại bỏ cục bụ̣ phõ̀n bị nhiờ̃m.
- Ít tụ́n điợ̀n năng và sản phõ̉m có thờ̉ sṍy khụ dờ̃ dàng. Bờn cạnh đó cũng có mụ̣t sụ́ nhược điờ̉m sau:
- Khó cơ giới hóa và tự đụ̣ng hóa.
- Khó khụ́ng chờ́ tuyợ̀t đụ́i điờ̀u kiợ̀n vụ trùng nờn dờ̃ bị nhiờ̃m.
- Phương pháp này khụng thích hợp đụ́i với trường hợp nuụi đờ̉ thu enzyme nụ̣i bào vì tờ́ bào vi sinh vọ̃t bám chặt vào các hạt mụi trường khó có thờ̉ tách sạch được.
3- Nuụi trong mụi trường lỏng (nuụi cấy chỡm)
Phương pháp nuụi trong mụi trường lỏng rṍt thích hợp cho vi khuõ̉n, nṍm men, các loại vi sinh vọ̃t đơn bào. Đụ́i với các vi sinh vọ̃t hiờ́u khí thì khi nuụi trong mụi trường lỏng phải cṍp khí bằng cách sục khí và khuṍy trụ̣n liờn tục đờ̉ khụng khí hòa tan liờn tục vào mụi trường vì vi sinh vọ̃t sử dụng chủ yờ́u là khí hòa tan.
Sục khí nghĩa là sử dụng máy nộn khí đờ̉ bơm khụng khí vào thiờ́t bị lợ̀n men. Khụng khí phải được vụ trùng bằng cách gia nhiợ̀t và làm nguụ̣i rụ̀i mới đưa vào thiờ́t bị lờn men hoặc có thờ̉ lọc vụ trùng. Dòng khụng khí đõ̉y vào thiờ́t bị lờn men phải được phõn phụ́i đờ̀u khắp đờ̉ đảm bảo lượng khí hòa tan cho vi sinh vọ̃t sử dụng.
Nhờ sự chuyờ̉n đụ̣ng của dòng khí trong mụi trường lỏng mà các chṍt dinh dưỡng, các tờ́ bào vi sinh vọ̃t cũng được phõn phụ́i đờ̀u khắp, làm tăng khả năng tiờ́p xúc của tờ́ bào vi sinh vọ̃t với cơ chṍt và mụi trường dinh dưỡng, làm tăng khả năng sinh sản, phát triờ̉n và tụ̉ng hợp enzyme.
Trong sản xuṍt, hợ̀ thụ́ng cṍp khí và thiờ́t bị lờn men phải phù hợp và được nghiờn cứu kỹ đờ̉ tăng hiợ̀u quả lờn men. (Hỡnh 4.1 ).
AM M S M A S A A M S 1 2 3
Hỡnh 4.1. Mụ hỡnh 3 loại thiết bị lờn men của Lefrancois với cỏc kiểu di chuyển của dòng khớ
A : Đường cṍp khí, M: Đường cṍp mụi trường, S: Đường tháo dịch
Khuṍy trụ̣n là quá trình cơ học, hợ̀ thụ́ng cánh khuṍy và mụtơ được thiờ́t kờ́ lắp đặt trong các thiờ́t bị lờn men. Khi cánh khuṍy chuyờ̉n đụ̣ng sẽ có tác dụng trụ̣n đờ̀u mụi trường, làm cho các tờ́ bào vi sinh vọ̃t và mụi trường khụng bị lắng xuụ́ng, làm tăng khả năng hòa tan khí vào mụi trường, làm tăng khả năng trao đụ̉i chṍt của vi sinh vọ̃t, lượng enzyme tụ̉ng hợp sẽ tăng lờn.
Hợ̀ thụ́ng khuṍy trụ̣n là rṍt cõ̀n thiờ́t, khụng chỉ trong trường hợp nuụi vi sinh vọ̃t hiờ́u khí mà ngay cả trong trường hợp nuụi vi sinh vọ̃t yờ́m khí. Cṍu tạo của cánh khuṍy và cách lắp đặt cánh khuṍy trong thiờ́t bị lờn men quyờ́t định cho dòng chuyờ̉n đụ̣ng của dịch mụi trường và tờ́ bào vi sinh vọ̃t trong thiờ́t bị lờn men (Hỡnh 4.2).
Trong thiờ́t bị lờn men nuụi vi sinh vọ̃t hiờ́u khí vừa có hợ̀ thụ́ng sục khí, vừa khuṍy trụ̣n thì sẽ làm tăng khả năng hòa tan của oxy vào mụi trường, vì khi cánh khuṍy hoạt đụ̣ng sẽ làm vỡ nhỏ các bóng khí, làm tăng diợ̀n tích tiờ́p xúc với mụi
trường, đụ̀ng thời, làm cho các bọt giữ lõu hơn trong dịch mụi trường. Nuụi cṍy chìm thường tạo nhiờ̀u bọt nờn phải sử dụng các chṍt phá bọt như Tween 20, axit oleic, vv ...
a b
Hỡnh 4.2. Dòng chuyển động của dịch mụi trường trong thiết bị lờn men với cỏc kiểu cỏnh khuấy khỏc nhau