Cụng nghệ sản xuất insulin trờn thế giớ

- Chất mang là polymer tổng hợp hóa học:

5. SẢN XUẤT PROTEIN 1 Sản xuất insulin

5.1.2. Cụng nghệ sản xuất insulin trờn thế giớ

Từ thọ̃p niờn 1920 cho đờ́n những năm đõ̀u thọ̃p niờn 1980, insulin được thu nhọ̃n chủ yờ́u bằng cách tách ly từ tuyờ́n tụy đụ̣ng vọ̃t như heo, bò, cừu. Tuy nhiờn, viợ̀c sản xuṍt và sử dụng sản phõ̉m insulin loại này cũng có mụ̣t sụ́ hạn chờ́. Insulin người có sự khác biợ̀t trong thành phõ̀n amino axit so với insulin bò và heo (như đã đờ̀ cọ̃p ở Chương 1). Do đó, khi sử dụng chờ́ phõ̉m insulin có nguụ̀n gụ́c từ heo và bò, đã có những trường hợp gõy ra những tác dụng phụ khụng mong muụ́n như dị ứng. Ngoài ra, quá trình sản xuṍt và tinh sạch insulin từ đụ̣ng vọ̃t cũng gặp nhiờ̀u khó khăn và giá thành cũng cao. Nhìn chung, sản phõ̉m insulin cung cṍp cho người có thờ̉ sản xuṍt bằng bụ́n phương pháp khác nhau sau đõy:

 Tỏch chiết từ tuyến tụy người

Tách chiờ́t insulin từ tuyờ́n tụy người khụng có ý nghĩa thực tiờ̃n do giới hạn vờ̀ nguụ̀n cung cṍp nguyờn liợ̀u ban đõ̀u.

 Tổng hợp húa học từ cỏc axit amin

Phương pháp tụ̉ng hợp hóa học dờ̃ tiờ́n hành nhưng khụng hiợ̀u quả kinh tờ́ do hiợ̀u suṍt rṍt thṍp.

 Biến đổi insulin heo hay phương phỏp bỏn tổng hợp

Phương pháp bán tụ̉ng hợp biờ́n đụ̉i insulin heo thành insulin người thụng qua viợ̀c thay thờ́ gụ́c alanine bằng threonine ở vị trí B30 được phát triờ̉n bởi cụng ty Novo Nordisk A/S (Đan Mạch). Tuy nhiờn, đõy là phương pháp khá đắt tiờ̀n do nguụ̀n cung cṍp tụy heo bị giới hạn cũng như viợ̀c phải thu nhọ̃n và xử lý nguụ̀n nguyờn liợ̀u rṍt phức tạp.

 Phương phỏp sản xuất insulin tỏi tổ hợp

Phương pháp này được xõy dựng khi con người có sự hiờ̉u biờ́t ngày càng sõu sắc hơn vờ̀ di truyờ̀n và kỹ thuọ̃t gen. Đờ̉ sản xuṍt insulin theo phương pháp này, người ta đã thực hiợ̀n các bước sau:

+ Cài gen mã hóa vào vector tạo dòng, tạo ADN tái tụ̉ hợp, + Biờ́n nạp ADN tái tụ̉ hợp vào vi khuõ̉n E. coli,

+ Sản xuṍt insulin từ dòng vi khuõ̉n E. coliđã nhọ̃n ADN tái tụ̉ hợp.

Sau khi tạo được dòng vi khuõ̉n có mang gen mã hóa cho insulin rụ̀i, viợ̀c sản xuṍt insulin tưởng chừng như đơn giản, tuy nhiờn, vṍn đờ̀ đã gặp khụng ít khó khăn, đặc biợ̀t là vờ̀ sự hình thành các liờn kờ́t disulfur trong phõn tử. Sản xuṍt insulin từ dòng vi khuõ̉n E. coli đã nhọ̃n ADN tái tụ̉ hợp, vờ̀ nguyờn tắc được thực hiợ̀n theo mụ̣t trong các cách sau:

Phương pháp hai chuỗi: Đõy là cụng nghợ̀ thành cụng đõ̀u tiờn trong lĩnh vực sản xuṍt insulin sinh tụ̉ng hợp dựa trờn cụng nghợ̀ tái tụ̉ hợp DNA. Cụng nghợ̀ này được phát triờ̉n bởi cụng ty Genetech và được thương mại hóa bởi cụng ty Eli Lilly. Mụ̃i chuụ̃i insulin được tụ̉ng hợp riờng biợ̀t trong vi khuõ̉n E. coli đờ̉ tạo thành protein ở thờ̉ vùi. Hai chuụ̃i peptide này được thu nhọ̃n từ thờ̉ vùi, tinh chờ́ và liờn kờ́t với nhau đờ̉ tạo thành insulin hoàn chỉnh (Hỡnh 4.16).

Hỡnh 4.16. Sản xuất insulin tỏi tổ hợp với chuỗi A và chuỗi B riờng biệt

Phương pháp proinsulin: Ở phương pháp này, phõn tử proinsulin được sản xuṍt ở dạng nguyờn vẹn, với đoạn peptid C liờn kờ́t chuụ̃i A và chuụ̃i B, tiờ́p sau đó,

proinsulin được cho gṍp cuụ̣n đờ̉ tạo thành các cõ̀u nụ́i disulfide và chuụ̃i peptide C được cắt bỏ bằng enzyme đờ̉ thu nhọ̃n insulin hoàn chỉnh (Hình 4.17).

Hỡnh 4.17. Sản xuất insulin theo mụ hỡnh mini-proinsulin

Đờ̉ thu nhọ̃n chờ́ phõ̉m, nhiờ̀u bước sắc ký và lọc màng được sử dụng nhằm tách chiờ́t và tinh sạch. Quy trình sản xuṍt proinsulin được thương mại hóa bởi cụng ty Eli Lilly. Tờ́ bào E. coli sản xuṍt vượt mức Trp-LE’-Met-proinsulin dưới dạng thờ̉ vùi. Các thờ̉ vùi này được thu nhọ̃n và hòa tan đờ̉ giải phóng proinsulin.

Phương pháp proinsulin ngày càng được cải tiờ́n và hoàn thiợ̀n, mụ hình mini- proinsulin đang được triờ̉n khai thực hiợ̀n. Mini-proinsulin có cṍu trúc tương tự với proinsulin, chỉ khác là thay thờ́ đoạn peptide C tự nhiờn của proinsulin gụ̀m 31 amino axit bằng mụ̣t đoạn peptide ngắn hơn (5 amino axit), giúp dờ̃ dàng cho viợ̀c tinh chờ́ và gia tăng hiợ̀u quả gṍp cuụ̣n dõ̃n đờ́n tăng hiợ̀u suṍt hình thành insulin có hoạt tính hơn mụ hỡnh proinsulin.

Cho đờ́n ngày nay, các nhà khoa học võ̃n chưa hiờ̉u rừ phương thức tác đụ̣ng của đoạn peptide C đụ́i với quá trình gṍp cuụ̣n của proinsulin. Tuy nhiờn, mụ̣t sụ́ nghiờn cứu gõ̀n đõy cho thṍy đoạn peptide C ngắn hơn làm tăng khả năng gṍp cuụ̣n lờn 20ữ40% so với proinsulin ở cùng nụ̀ng đụ̣.

Hiợ̀n tại, người ta võ̃n tiờ́p tục phát triờ̉n những phương pháp sản xuṍt insulin tái tụ̉ hợp. Mục đích của những nghiờn cứu, phát minh hiợ̀n tại là muụ́n phát triờ̉n mụ̣t hợ̀ thụ́ng biờ̉u hiợ̀n và phương pháp sản xuṍt insulin có năng suṍt cao ngang bằng hay vượt trụ̣i so với những hợ̀ thụ́ng sản xuṍt insulin trước đõy. Các nghiờn cứu trong giai đoạn này nhằm cải tiờ́n phương pháp cụ̉ điờ̉n chuyờ̉n các tiờ̀n chṍt của insulin thành insulin, nghiờn cứu ra mụi trường tụ́i ưu cho viợ̀c hình thành các cõ̀u nụ́i cõ̀n thiờ́t cho viợ̀c biờ̉u hiợ̀n hoạt tính của insulin, tìm ra hợ̀ thụ́ng biờ̉u hiợ̀n insulin cho năng suṍt, sản lượng cao.

Sơ lược mụ̣t quy trình lờn men mini-proinsulin trong mụi trường lỏng, có khuṍy trụ̣n, có kiờ̉m soát các điờ̀u kiợ̀n nuụi như pH, nhiợ̀t đụ̣, lưu lượng khí - bao gụ̀m 2 bước chính sau:

 Nuụi chủng vi sinh vật cú chứa ADN tỏi tổ hợp (E. coli) - Quỏ trỡnh bao gụ̀m các bước:

- Chuõ̉n bị giụ́ng, mụi trường và thiờ́t bị lờn men, - Lờn men,

- Ly tõm thu sinh khụ́i tờ́ bào,

- Kiờ̉m tra sự biờ̉u hiợ̀n mini-proinsulin bằng điợ̀n di SDS-PAGE, - Xác nhọ̃n sự biờ̉u hiợ̀n mini-proinsulin bằng điợ̀n di Western-Blot.

 Thu nhận insulin

Sau khi nuụi vi sinh vọ̃t đờ̉ thu sinh khụ́i, bước tiờ́p theo là tách chiờ́t và thu nhọ̃n mini-proinsulin và chuyờ̉n mini-proinsulin thành insulin - Qui trình được trình bày ở hỡnh 4.18:

Từ thờ̉ vùi, đờ̉ thu nhọ̃n protein cú cṍu hỡnh gṍp cuụ̣n tự nhiờn, cõ̀n làm tan cỏc phõn tử protein trong thờ̉ vựi bằng húa chṍt biờ́n tính, sau đó, tiờ́n hành tỏi gṍp cuụ̣n protein tan thu được. Trong trường hợp này, viợ̀c tiờ́n hành tỏi gṍp cuụ̣n mụ̣t cỏch hiợ̀u quả cõ̀n được nghiờn cứu và khảo sỏt nghiờm ngặt.

Tại Viợ̀t Nam hiợ̀n nay, giáo sư Trõ̀n Linh Thước thuụ̣c Đại học quụ́c gia thành phụ́ Hụ̀ Chí Minh đã nghiờn cứu sản xuṍt insulin theo mụ hỡnh mini-proinsulin, bước đõ̀u đã thu được những kờ́t quả khả quan.

Hỡnh 4.18. Qui trỡnh chiết tỏch và tinh chế insulin từ sinh khối tế bào

Ghi chỳ - MPI: Mini-proinsulin