- O CH2 COOH phõn ly
3.2.3. Sắc ký lọc gel (Sắc ký rõy phõn tử)
Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau vờ̀ kích thước hình dạng và phõn tử lượng của enzyme có trong hụ̃n hợp đờ̉ tách chúng ra.
Đờ̉ đảm bảo cho viợ̀c tách protein được tụ́t, hạt gel hay còn gọi là chṍt rõy phõn tử phải là chṍt trơ, khụng phản ứng với protein. Chṍt này cũng khụng hòa tan và tương đụ́i bờ̀n với các yờ́u tụ́ vờ̀ cơ học cũng như sinh học. Ngoài ra chṍt được sử dụng cho mục đích lọc phõn tử phải là chṍt khụng có tính đàn hụ̀i (khụng co) và phải là chṍt ưa nước (hydrophyl).
Gel sephadex là chṍt thoả mãn các yờ́u tụ́ trờn. Sephadex là chờ́ phõ̉m dextran do các loài vi sinh vọ̃t khác nhau là Leuconostoc tạo ra khi chúng được nuụi cṍy trờn mụi trường chứa saccharose. Trọng lượng phõn tử của dextran có thờ̉ đạt tới hàng triợ̀u và
lớn hơn. Phõn tử dextran bao gụ̀m các chuụ̃i do các gụ́c glucose tạo thành các liờn kờ́t glycosid 1,6. Sephadex nhọ̃n từ dextran bằng cách xử lý hóa học (do tác dụng của epichlohidrin) đờ̉ tạo ra các lưới phõn nhánh có liờn kờ́t ngang gọi là "sàng phõn tử" và chṍt này trở thành khụng tan trong nước. Sụ́ liờn kờ́t ngang tạo ra càng nhiờ̀u, kích thước của lụ̃ sàng phõn tử càng nhỏ.
Phương pháp lọc trờn sephadex được tiờ́n hành như sau: cho sephadex vào cụ̣t thủy tinh dài và cõn bằng bằng dung dịch đợ̀m có pH nhṍt định. Sau đó cho dung dịch protein lờn cụ̣t. Khi lọc và chiờ́t bằng dung mụi thích hợp, các phõn tử có trọng lượng phõn tử nhỏ (ở đõy là các muụ́i) sẽ khuyờ́ch tán chọ̃m chạp qua các lụ̃ nhỏ của các hạt Sephadex (đó bị trương phồng), còn chṍt có trọng lượng phõn tử lớn hơn (ở trường hợp này là protein) khụng có khả năng đi vào bờn trong hạt mà lách nhanh qua khe hở giữa các hạt sephadex và sẽ rơi xuụ́ng trước (Hình 2.5 và hình 2.6). Vì vọ̃y ta có thờ̉ tách được chṍt có trọng lượng phõn tử cao hơn ra khỏi chṍt có phõn tử lượng nhỏ.
Hỡnh 2.5. Hoạt động của lọc phõn tử sephadex
Hỡnh 2.6. Tỏch cỏc phõn tử theo kớch thước bằng sắc ký lọc gel
Cú 8 chờ́ phõ̉m dạng thương mại của Sephadex từ G -10 có đụ̣ xụ́p nhỏ nhṍt đờ́n G-200 có đụ̣ xụ́p lớn nhṍt. Lụ̃ xụ́p càng lớn, càng có nhiờ̀u nước liờn kờ́t trong hạt khi chúng nở. Chỉ sụ́ kốm theo ký hiợ̀u của Sephadex cho biờ́t sụ́ ml nước liờn kờ́t với 10 gel khụ. Sephadex, trong đa sụ́ trường hợp đượ c chia làm hai loại : loại thụng thường,
a. thời điờ̉m đưa hụ̃n hợp vào cụ̣t b. Bắt đõ̀u phõn đoạn b. Bắt đõ̀u phõn đoạn
c. Phõn đoạn có phõn tử lớn nhṍt bắt đõ̀u đi ra khỏi cụ̣t bắt đõ̀u đi ra khỏi cụ̣t
có đường kính từ 40 ữ 120 àm và loại mịn đường kính từ 10ữ40 àm. Loại mịn được gọi là ”superfine”. Riờng hai loại sephadex phụ̉ biờ́n nhṍt là G -25 và G-50, được chia làm 3 loại: ”fine” (20 ữ 80 àm), ”medium” (50 ữ 150 àm) và ”Coarse” (100ữ 300 àm).
Tuy nhiờn trong thực tờ́ các hạt có đụ̣ biờ́n thiờn đường kính khá lớn, có thờ̉ đờ́n ± 50%. Đặc tính của sephadex được giới thiợ̀u trong bảng 2.3. trong bảng nờu các giá trị thờ̉ tính riờng của hạt sephadex đã nở phụ̀ng được nhụ̀i vào cụ̣t. Các sụ́ liợ̀u này rṍt hữu ích cho viợ̀c chuõ̉n bị vọ̃t liợ̀u đờ̉ nhụ̀i cụ̣t.
Bảng 2.3. Đặc tớnh của Sephadex
Loại Sephadex Vùng phõn đoạn cho protein hình cầu (1000 dalton)
Thể tớch riờng của hạt nhụ̀i trờn 1g sephadex khụ G-10 <0,7 2 – 3 G-15 <1,5 2,3 – 3,5 G-25 1 – 5 4 – 6 G-50 1,5 – 30 9 – 11 G-75 3 – 80 12 – 15 G-75 3 – 70 15 – 20 Superfine G-100 4 – 150 15 – 20 G-100 4 – 100 15 – 20 Superfine G-150 5 – 300 20 – 30 G-150 5 – 150 18 – 22 Superfine G-200 5 – 600 30 – 40 G-200 5 – 250 20 – 25
Ngoài sephadex là nhóm chṍt rõy phõn tử (gel) có nguụ̀n gụ́c polysaccharid (dextran) do Hóng pharmacia (Thụy Điờ̉n) sản xuṍt, hiợ̀n nay người ta còn s ử dụng Molselect (Do hóng Reanal - Hungary sản xuṍt) nhiờ̀u trong nghiờn cứu.
Chṍt này có thờ̉ dùng đờ̉ làm cụ đặc các chṍt có trọng lượng phõn tử lớn như protein, peptid, loại muụ́i khỏi protein (dùng nhanh hơn so với thõ̉m tích), lọc gel tách theo trọng lượng phõn tử (như protein huyờ́t thanh) hoặc tách các sản phõ̉m protein được hình thành dưới tác dụng của enzyme phõn cắt (như γ - G - globulin bị cắt bởi papain).
Bảng 2.4. Đặc tớnh của cỏc loại Molselect
Loại Molselect Trọng lượng phõn tử của chất cần được tách
(Dalton)
Loại Molselect Trọng lượng phõn tử của chất cần được tách (Dalton) G-15 <1500 G-25 100 – 5000 G-50 500 – 10000 G-75 1000 – 50.000 G-100 1000 – 100.000 G-200 100 – 200.000
Các Molselect cũng có ký hiợ̀u từ G10 đờ́n G200 phục vụ trong viợ̀c lọc phõn tử cho phộp các chṍt có trọng lượng phõn tử khác nhau lọt vào ở các ngưỡng khác nhau được trình bày trong bảng 2.4
Ngoài nhóm chṍt rõy phõn tử là chờ́ phõ̉m dextran còn có nhóm chṍt rõy phõn tử là chờ́ phõ̉m gel acrylamide bao gụ̀m Biogel (BioRad) và Acrilex (Reanal). Acrilex gel là loại copolime, sản phõ̉m của Hungary được tạo ra từ acrylamide và N, N' - methylen -bis - acrylamide. Các acrilex gel có ký hiợ̀u từ P - 2 đờ́n P -300 dùng đờ̉ tách các chṍt có trọng lượng phõn tử trong ngưỡng từ 100 đờ́n 300.000. Có thờ̉ sử dụng ở vùng pH từ 2ữ11. Chṍt thứ ba là agarose loại sulphate. Hay phụ̉ biờ́n là loại sepharose (pharmacia). Người ta thường dùng chṍt này đờ̉ tách các phõn tử có trọng lượng lớn hơn 106.
Tóm lại bằng phương pháp lọc phõn tử người ta có thờ̉ tách các chṍt có trọng lượng phõn tử khác nhau có trong hụ̃n hợp (như polymer, polysaccharid, nucleic acid , protein) ra. Người ta có thờ̉ dùng kỹ thuọ̃t này đờ̉ loại muụ́i thay cho quá trình thõ̉m tích. Và hơn thờ́ nữa, trong quá trình tinh chờ́ protein enzyme, chúng còn được sử dụng đờ̉ cụ đặc dung dịch protein enzyme.
Viợ̀c sắc ký, lọc phõn tử protein hoặc chiờ́t xuṍt protein thường thu được dung dịch loãng, nờ́u khụng cụ đặc dung dịch đờ̉ cho phù hợp đụ́i với các nghiờn cứu tiờ́p theo thì khụng dùng được. Molselect G - 25 rṍt thích hợp cho viợ̀c cụ đặc các dung dịch loãng của các chṍt có trọng lượng phõn tử lớn như protein, peptid. Bằng cách trụ̣n với dung dịch protein loãng, Moltelect sẽ nhọ̃n nước và chṍt có trọng lượng phõn tử nhỏ, như vọ̃y dung dịch protein được cụ đặc mà khụng có sự thay đụ̉i vờ̀ pH và lực ion của nó.