Thu dịch ly tõm Tinh chế Nguyờn liệu Chế phẩm tinh Chế phẩm thụ
Kờ́t tủa bằng (NH4)2SO4: muụ́i sulphat amon nằm ở dạng tinh thờ̉ nờn chỉ cõ̀n cõn muụ́i và bụ̉ sung trực tiờ́p vào dịch chiờ́t enzyme. Nụ̀ng đụ̣ muụ́i đờ̉ kờ́t tủa thường được nhiờ̀u tác giả sử dụng là 60% bảo hòa, cũng có tác giả sử dụng nụ̀ng đụ̣ cao hơn. Theo Nguyờ̃n Đức Lượng là 532g/1lit dịch chiờ́t. Sau khi ly tõm tách tủa thì trong sản phõ̉m còn mụ̣t lượng muụ́i đáng kờ̉ nờn có thờ̉ loại muụ́i sau đó bằng phương pháp thõ̉m tích. Thõ̉m tích là sự khuyờ́ch tán chṍt tan vào dung mụi qua màng bán thṍm. Màng bán thṍm thường sử dụng là cellophane. Cho dung dịch enzyme có lõ̃n muụ́i vào túi cellophane buụ̣c chặt và bỏ vào bờ̉ dung mụi (nước), khuṍy trụ̣n trong nhiờ̀u giờ đờ̉ muụ́i khuyờ́ch ra ngoài còn enzyme có trọng lượng phõn tử lớn khụng đi qua màng bán thṍm được và kờ́t quả muụ́i được loại bỏ.
-Tinh chờ́ enzyme: đờ̉ tinh chờ́ enzyme người ta thường sử dụng phương pháp sắc ký. Có nhiờ̀u loại sắc ký như trao đụ̉i ion, sắc ký bản mỏng, sắc ký rõy phõn tử (lọc gel)... Các phương pháp đã được trình bày ở chương 2.
Ngoài phương pháp đã giới thiợ̀u ở trờn, bromelain còn được thu nhọ̃n bằng phương pháp hṍp phụ. Bromelain có khả năng hṍp phụ lờn carboxyl metyl cellulose (CMC). Sau khi cho hṍp phụ xong thì thực hiợ̀n phản hṍp phụ bằng dung dịch đợ̀m phosphat 0,05M ở pH = 7,1. Ngoài CMC người ta còn sử dung kaolin đờ̉ hṍp phụ bromelain. Cho kaolin khụ (hoặc đã ngõm cho trương nở) vào dung dịch có chứa enzyme với tỉ lợ̀ 25 mg kaolin/1ml dung dịch, khuṍy đờ̀u mụ̣t thời gian và sau đó ly tõm đờ̉ thu tủa. kờ́t tủa được goi là bromelain-kaolin.
2.2.3. Thu nhận enzyme từ hạt nảy mầm
a. Đặc điểm của enzyme từ hạt nảy mầm
Hạt nảy mõ̀m được sửu dụng từ lõu trong sản xuṍt bia (malt), trong sản xuṍt kẹo mạch nha, làm nguụ̀n nguyờn liợ̀u đờ̉ sản xuṍt bụ̣t dinh dưỡng giàu men tiờu hóa cho trẻ em và người già. Trong phõ̀n này chúng tụi tọ̃p trung trình bày vờ̀ sản xuṍt malt, vì đõy là nguụ̀n nguyờn liợ̀u chủ yờ́u đờ̉ sản xuṍt bia.
Trong hạt ngũ cụ́c, đặc biợ̀t là đại mạch có nhiờ̀u thành phõ̀n dinh dưỡng như protein, tinh bụ̣t, chṍt bộo, khoáng, vitamin, enzyme. Hai thành phõ̀n chính trong hạt đại mạch là tinh bụ̣t (khoảng 69,4% trọng lượng khụ) và protein (khoảng 11,6% trọng lượng khụ).
Trong quá trình nảy mõ̀m các enzyme được hoạt hóa, chuyờ̉n từ trạng thái khụng hoạt đụ̣ng sang trạng thái hoạt đụ̣ng. Hạt đại mạch khụ, trước khi ngõm vào nước khụng có hoạt lực enzyme, đặc biợ̀t là amylase nhưng sau khi ngõm thì hoạt lực enzyme tăng lờn mạnh mẽ và đạt giá trị cực đại vào ngày thứ 7, sau đó giảm xuụ́ng. Cỏc enzyme được hoạt hóa trong giai đoạn nảy mõ̀m chủ yờ́u là các enzyme phõn giải như amylase phõn giải tinh bụ̣t, protease phõn giải protein, lipase phõn giải lipit và cỏc enzyme oxy hóa làm tăng hoạt đụ̣ng hụ hṍp của hạt. Vờ̀ mặc sinh lý cõy trụ̀ng thì nhờ sự phõn giải các chṍt hữu cơ của các enzyme mà mõ̀m có nguụ̀n dinh dưỡng dờ̃ hṍp thụ đờ̉ phát triờ̉n.
Enzyme trong hạt mõ̀m đặc biợ̀t quan trọng trong cụng nghiợ̀p sản xuṍt bia. Hai nhúm enzyme được quan tõm nhiờ̀u nhṍt đó là amylase và protease.
Amylase thủy phõn tinh bụ̣t dự trữ trong hạt đại mạch thành đường đơn giản, dờ̃ hṍp thụ đờ̉ làm nguụ̀n dinh dưỡng cho nṍm men bia. Enzyme thủy phõn tinh bụ̣t trong malt gụ̀m cú α-amylase, β-amylase, invertase, sitase...
Enzyme thủy phõn protein (protease) thành các sản phõ̉m trung gian như pepton, peptid, cỏc oligopeptid và axit amin.
Ngoài cỏc enzyme kờ̉ trờn còn có các enzyme oxy hóa khử hoạt đụ̣ng trong quá trình hụ hṍp của hạt.
Từ lõu con người đã biờ́t sử dụng nguụ̀n enzyme này đờ̉ sản xuṍt bia. Trong quá trình nảy mõ̀m khi các enzyme trong hạt được hình thành cao nhṍt, hoạt đụ̣ng mạnh nhṍt thì người ta thực hiợ̀n sṍy tách nước đờ̉ làm cho mõ̀m chờ́t khụng thờ̉ tạo cõy con, lượng enzyme và các thành phõ̀n dinh dưỡng của hạt được sử dụng cho quá trình lờn men.
Chṍt lượng của malt, tức là lượng enzyme và thành phõ̀n dinh dưỡng của malt, trước tiờn, phụ thuụ̣c vào loại và chṍt lượng của hạt sau đó phụ thuụ̣c vào qui trình nảy mõ̀m và sṍy.
b. Sản xuất malt
Sản xuṍt malt có thờ̉ coi như mụ̣t qui trình thu nhọ̃n enzyme của hạt, tuy nhiờn trong qui trỡnh này enzyme khụng cõ̀n tách ra khỏi nguụ̀n nguyờn liợ̀u vì các enzyme thu nhọ̃n được trong quá trình nảy mõ̀m sau này lại được sử dụng đờ̉ thủy phõn các cơ chṍt có chính trong hạt.
Quá trình sản xuṍt bao gụ̀m các cụng đoạn như ngõm hạt, nảy mõ̀m, sṍy malt tươi, tách mõ̀m và bảo quản malt khụ. Mụ̣t sụ́ điờ̉m cõ̀n lưu ý trong các cụng đoạn sản xuṍt:
- Ngõm hạt: Hạt được ngõm trong nước sạch cho đờ́n khi đạt được cõn bằng vờ̀ đụ̣ õ̉m (bảo hòa nước), trong khi ngõm có đảo trụ̣n thường xuyờn. Mục đích của giai đoạn này là tạo đụ̣ õ̉m cho hạt trong điờ̀u kiợ̀n thuọ̃n lợi cho hạt nảy mõ̀m.
- Nảy mõ̀m: Sau khi ngõm hạt được vớt ra. rửa lại và ử mõ̀m. Từ ngày thứ 7 đờ́n thứ 8 của quá trình nảy mõ̀m nhiợ̀t đụ̣ của khụ́i mõ̀m đạt tụ́i đa sau đó giảm xuụ́ng, hoạt lực enzyme trong giai đoạn này là cao nhṍt. Dừng quá trình nảy mõ̀m khi hoạt lực enzyme đạt tụ́i đa bằng cách sṍy đờ́n khụ ở nhiợ̀t đụ̣ thích hợp.
Qui trình chung đờ̉ sản xuṍt các loại đại mạch được trình bày tại hình 4.7.
Hỡnh 4.7. Sơ đồ dõy chuyền sản xuất malt
Đại mạch Làm sạch phõn loại
Sấy khụ Bảo quản Nước Ngõm Nảy mầm Sấy khụ Tách rễ Malt khụ Bảo quản
Mụ̣t sụ́ chỉ tiờu của malt tươi: hạt mờ̀m, bóp vụn được nhưng khụng nhão, chiờ̀u dài mõ̀m bằng 2/3 cho đờ́n bằng chiờ̀u dài hạt. Chiờ̀u dài rờ̃ bằng từ 1/2 đờ́n 2 lõ̀n chiờ̀u dài hạt.
Sṍy: Lúc đõ̀u khi đụ̣ õ̉m của hạt còn cao thì phải sṍy ở nhiợ̀t đụ̣ thṍp đờ̉ tránh làm biờ́n tính các enzyme trong hạt. Khi đụ̣ õ̉m giảm xuụ́ng thì có thờ̉ tăng nhiợ̀t đụ̣ sṍy, nhưng cõ̀n lưu ý nhiợ̀t đụ̣ sṍy khụng quá cao dõ̃n đờ́n xảy ra phản ứng melanoidin làm hạt có màu khụng phù hợp.
Phụ thuụ̣c vào chờ́ đụ̣ sṍy mà người ta thu được nhiờ̀u loại malt có màu sắc và chṍt lượng khác nhau như malt vàng, malt đen...
3. SẢN XUẤT ENZYME TỪ NGUễ̀N ĐỘNG VẬT
Nhiờ̀u enzyme của đụ̣ng vọ̃t được phát hiợ̀n và nghiờn cứu kỹ, tuy nhiờn, các enzyme thu nhọ̃n từ nguụ̀n đụ̣ng vọ̃t thì các protease chiờ́m ưu thờ́. Phõ̀n lớn các protease của đụ̣ng vọ̃t là enzyme của hợ̀ tiờu hóa. Mụ̣t sụ́ enzyme protease tiờu biờ̉u như: Pepsin, tripsin, rennin, chymotripsin.
3.1. Thu nhận rennin từ dạ dày bờ
3.1.1. Đặc điờ̉m của rennin
Rennin được tìm thṍy ở dịch tiờu hóa trong ngăn thứ tư của dạ dày bờ dưới 5 tháng tuụ̉i. Rennin là enzyme làm đụng tụ sữa và phõn giải protein. Enzyme này do chính tờ́ bào của tuyờ́n dạ dày tiờ́t ra. Enzyme này giúp tiờu hóa sữa cho con vọ̃t mới sinh. Khi con vọ̃t lớn, bắt đõ̀u ăn được thì rennin khụng tụ̉ng hợp nữa mà thay vào đó, tờ́ bào tuyờ́n dạ dày tụ̉ng hợp pepsin.
Rennin tinh khiờ́t có điờ̉m đẳng điợ̀n pI=4,5. Rennin thủy phõn liờn kờ́t peptid và khụng làm ảnh hưởng đờ́n liờn kờ́t ester. Rennin đặc biợ̀t tác đụ̣ng mạnh lờn liờn kờ́t peptid giữa 2 axit amin là tyrosine và phenylalanine.
Đặc tính thủy phõn của rennin đụ́i với cazein phụ thuụ̣c nhiờ̀u vào pH. Ở pH=6,8 rennin phõn cắt trung bình 1/33 sụ́ liờn kờ́t peptid có trong phõn tử cazein, còn ở pH = 2,3 thỡ phõn cắt 1/8.
Rennin có thờ̉ nằm dưới dạng khụng hoạt đụ̣ng (zymogen) là prorennin. Đờ̉ chuyờ̉n từ dạng prorennin sang dạng rennin hoạt đụ̣ng, người ta sử dụng tác nhõn axit và tỏc nhõn enzyme. Prorennin được hoạt hoá ở pH<5, ở pH dưới 3 thì quá trình này xảy ra mạnh mẽ. Mụ̣t sụ́ nghiờn cứu cho thṍy: prorennin được hoạt hoá bằng Pancreatin (hụ̃n hợp của tripsin, chymotripsin, peptidase, lipase và amylase) ở pH = 5,5. Ở pH này, sự hoạt hoá bằng axit khụng thờ̉ xảy ra. Sự hoạt hoá prorennin có thờ̉ thực hiợ̀n với enzyme pepsin ở pH=2, nhưng ở pH từ 5,5 đờ́n 6 thì quá trình này xảy ra khụng đáng kờ̉. Hoạt đụ̣ng xúc tác tụ́i ưu của rennin ở khoảng pH từ 3,4 đờ́n 4. Đặc điờ̉m của rennin là tác đụ̣ng ở mụi trường axit và cõ̀n có sự hiợ̀n diợ̀n của ion canxi (Ca+2). Ở pH=3,7 ion Ca+2 làm tăng đụ̣ hoạt đụ̣ng của renin.
Rand và Ernstron đã chứng minh rằng, rennin hoạt đụ̣ng nhanh ở pH=2 trong NaCl và hoạt đụ̣ng chọ̃m ở pH=5. Tuy nhiờn, ở pH=2, hình thờ̉ của rennin khụng ụ̉n định, còn ở pH=5 thì ụ̉n định hơn, thờm vào đó, ở nụ̀ng đụ̣ NaCl 2M sẽ tăng khả năng hoạt đụ̣ng của enzyme.
Theo nghiờn cứu của Foltman thì, khi tăng pH dõ̀n đờ́n 6,3 trung tõm hoạt đụ̣ng của enzyme bị phõn huỷ dõ̀n dõ̀n và mṍt ụ̉n định. Rennin khụng bị mṍt hoạt tính nhanh trong mụi trường kiờ̀m yờ́u (pH=9) mà bị mṍt hoạt tính từ từ khi tiờ́p xỳc lõu. Chṍt kìm hãm hoạt đụ̣ng của rennin là H2S-0,0001M và MgCl2. Prorennin và rennin bị vụ hoạt nhanh chóng bởi urờ.
3.1.2. Thu nhận rennin
Thu nhận dung dịch rennin: Rennin có thờ̉ thu nhọ̃n từ đụ̣ng vọ̃t non còn sụ́ng trong khoảng 3 đờ́n 4 tháng tuụ̉i, bằng cách sử dụng ụ́ng hút dịch hoặc thu nhọ̃n từ dạ dày bờ con sau khi giờ́t thịt. Dạ dày bờ thu nhọ̃n tại các lò mụ̉, sau đó có thờ̉ sṍy khụ hoặc rửa sạch và ướp muụ́i. Lớp dạ dày gỡ ra còn nguyờn, được thụ̉i phụ̀ng lờn bằng khụng khí và làm khụ. Dạ dày ướp muụ́i sau đó cũng sṍy khụ. Dạ dày khụ được nghiờ̀n nhỏ và chiờ́t tách bằng dung dịch NaCl, hoặc có thờ̉ chiờ́t tách bằng HCl ở nụ̀ng đụ̣ thích hợp. Gõ̀n đõy người ta cũng đã thực hiợ̀n chiờ́t rennin từ dạ dày ướp muụ́i chưa làm khụ, nhưng mức đụ̣ chiờ́t chọ̃m hơn so với dạ dày khụ.
Dung dịch rennin chiờ́t được người ta còn gọi là rennet, dịch rennet được bảo quản ở nụ̀ng đụ̣ muụ́i cao 14ữ20% và có thờm chṍt bảo quản như propylene glycol, benzoat natri. Dịch rennet chiờ́t được chứa rennin hoạt đụ̣ng và prorennin khụng hoạt đụ̣ng, do đó, phải thờm axit vào đờ̉ hiợ̀u quả chiờ́t tách đạt tụ́i đa.
Hỡnh 4.8. Sơ đồ 1 thu nhận chế phẩm rennin
Theo mụ̣t sụ́ nghiờn cứu thì pH = 4ữ5 là thích hợp. Qui trình chiờ́t có thờ̉ được tiờ́n hành theo các sơ đụ̀ hình 4.8.
- Nguyờn liợ̀u: Ngăn thứ 4 của dạ dày bờ non dưới 5 tháng tuụ̉i, loại bỏ thức ăn dư và mỡ, rửa bằng dung dich muụ́i NaCl 15%.
- Phương pháp sṍy và nhiợ̀t đụ̣ sṍy khụng làm mṍt hoạt tính enzyme.
- Nờ́u khụng sṍy khụ thì có thờ̉ xay nhuyờ̃n trong HCl 0,2% có bụ̉ sung chṍt bảo quản, hoặc xay nhuyờ̃n trong dung dịch NaCl 10%, điờ̀u chỉnh pH=4 với tỉ lợ̀ nguyờn liợ̀u và dung dịch 1/3.
- Sản phõ̉m thu được còn lõ̃n NaCl, và chṍt bảo quản. Rennin cũng có thờ̉ thu nhọ̃n theo qui trình sau:
Hỡnh 4.9. Sơ đồ 2 thu nhận chế phẩm rennin
- Nguyờn liợ̀u được cắt nhỏ, mỏng phõ̀n có chứa enzyme và bỏ vào dung dịch HCl cú pH = 2-3.
Nguyờn liệu Cắt nhỏ pH=2-3 Ủ ở 42 o