- O CH2 COOH phõn ly
b: Dòng dịch chuyờ̉n đụ̣ng theo phương ngang
1.3.1. Thu nhận enzyme amylase 1 Phõn loại enzyme amylase
1- Phõn loại enzyme amylase
Hiợ̀n nay người ta chia amylase ra làm sỏu loại, được xờ́p vào hai nhúm: Endoamylase (enzyme nụ̣i bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào).
- Endoamylase gụ̀m có α-amylase và nhúm enzyme khử nhỏnh. Nhúm enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiờ́p là Pullulanase (hay α-dextrin 6- glucose), khử giỏn tiờ́p là transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) và amylose -
1,6-glucosidase. Cỏc enzyme này thủy phõn cỏc liờn kờ́t bờn trong của chuụ̃i polysaccharid.
- Exoamylase gụ̀m có β - amylase và γ - amylase. Đõy là những enzyme thủy phõn tinh bụ̣t từ đõ̀u khụng khử của chuụ̃i polysaccharid.
a. α-amylase (Tờn hệ thống α-1-4-glucanhidrolase)
Enzyme này xúc tác thủy phõn liờn kờ́t α-1-4-glycozit nằm ở bờn trong của các phõn tử tinh bụ̣t, glycogen. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose (Am) bị phõn cắt thành cỏc oligosaccharid gụ̀m 6 ữ7 gụ́c glucose. Sau đó các oligosaccharid này bị phõn cắt thành maltotetrose, maltotriose và maltose. Sau mụ̣t thời gian dài dưới tác dụng của α-amylase, amylose sẽ bị thủy phõn thành 23 % glucose và 87 % maltose.
Đụ́i với amylopectin (Ap), quá trình cũng xảy ra tương tự nhưng vì α- amylase khụng phõn cắt được liờn kờ́t α-1-6-glycozit ở mạch nhánh của phõn tử amylopectin nờn sản phõ̉m thủy phõn sẽ gụ̀m 72% maltose, 19% glucose, 8% dextrin phõn tử thṍp và izomaltose.
Tuy nhiờn, trong mụ̣t khoảng thời gian ngắn (30ữ60 phút), α-amylase chỉ thủy phõn tinh bụ̣t chủ yờ́u thành dextrin thṍp phõn tử và mụ̣t ít đường maltose. Vì vọ̃y, người ta gọi enzyme này là amylase dextrin hay amylase dịch hóa.
b. β-amylase (α-1-4-glucan-maltohidrolase)
Enzyme này xúc tác thủy phõn liờn kờ́t α-(1-4)-glycozit, tuõ̀n tự từng gụ́c maltose mụ̣t bắt đõ̀u từ đõ̀u khụng khử của mạch. Nó hõ̀u như khụng thủy phõn hạt tinh bụ̣t nguyờn mà chỉ thủy phõn tinh bụ̣t đã được hụ̀ hóa. Nó có khả năng thủy phõn 100% amylose thành maltose và 54ữ55% amylopectin thành maltose.
Quá trình thủy phõn amylopectin bắt đõ̀u từ đõ̀u khụng khử của nhánh ngoài cùng, mụ̃i nhánh này có khoảng 20ữ26 gụ́c glucose nờn sẽ tạo ra được khoảng 10ữ13 phõn tử maltose. Khi gặp liờn kờ́t α-(1-4) đứng kờ̀ cọ̃n liờn kờ́t α-(1-6)thỡ α-amylase ngừng tác dụng. Phõ̀n còn lại khụng bị tác dụng gọi là β-dextrin chứa tṍt cả các liờn kờ́t α-1-6-glycosit.
Vì vọ̃y, nờ́u cho cả α và β-amylase đụ̀ng thời thủy phõn tinh bụ̣t thì hiợ̀u suṍt thủy phõn có thờ̉ đạt 95%.
c. Glucoamylase (α-1-4-glucan glucohidrolase)
Enzyme này thủy phõn liờn kờ́t α-(1-4) và α-(1-6) được tách ra lõ̀n đõ̀u tiờn từ
Aspergillus awamori. Sau đó, nó còn được tìm thṍy ở Asp.niger, Asp.oryzae và cỏc vi sinh vọ̃t khác.
Glucoamylase là enzyme ngoại bào, nó thủy phõn cả liờn kờ́t α-(1-2) và α-(1-3) glycozit. Nó có khả năng thủy phõn hoàn toàn tinh bụ̣t, glycogen, amilopectin, amylose, dextrin, maltose, vv... đờ́n sản phõ̉m cuụ́i cùng là glucose.
Đa sụ́ glucoamylase đờ̀u hoạt đụ̣ng được ở điờ̀u kiợ̀n pH thṍp: pHopt = 3,5ữ5 và nhiợ̀t đụ̣ cao: topt = 50ữ60ºC. Hiợ̀n nay enzyme này đang đứng đõ̀u vờ̀ mặt hiợ̀u quả thủy phõn tinh bụ̣t và các sản phõ̉m trung gian. Vì thờ́, viợ̀c sử dụng glucoamylase tách từ các chủng vi sinh vọ̃t có ý nghĩa rṍt lớn trong sản xuṍt rượu, bia, mạch nha, vv...
Asp.oryzae là mụ̣t trong những chủng nṍm mụ́c có khả năng tụ̉ng hợp glucoamylase cao cũng như các loại enzyme amylase khỏc.
Vì vọ̃y, nghiờn cứu các điờ̀u kiợ̀n đờ̉ tuyờ̉n chọn, nuụi cṍy Asp.oryzae cho hiợ̀u quả cao có ý nghĩa quan trọng trong viợ̀c sản xuṍt các chờ́ phõ̉m enzyme từ vi sinh vọ̃t nói chung và từ nṍm mụ́c nói riờng.
d. Oligo-1, 6-glycosydase
Thủy phõn các liờn kờ́t α-1-6-glycozit trong izomaltose, các dextrin tới hạn và chuyờ̉n hóa chúng đờ́n các loại đường có thờ̉ lờn men được. Các loài nṍm mụ́c như
Asp.awamori, Asp.usami, Asp.oryzaecó khả năng sinh tụ̉ng hợp enzyme này.
e. α-glycosydase (maltase):
Enzyme này có tác dụng thủy phõn đường maltose thành glucose nhưng lại khụng có khả năng thủy phõn tinh bụ̣t. Do đó, nó giúp cho quá trình lờn men cuụ́i chuyờ̉n đường thành rượu etylic, nõng cao hiợ̀u suṍt lờn men. Nhiờ̀u loại nṍm mụ́c có khả năng sinh tụ̉ng hợp ra enzyme này.
f. Transglucosylase
Enzyme này thường tụ̀n tại song song với glucoamylase trong chờ́ phõ̉m của các nṍm mụ́c Aspergillus. Nó có hoạt tính thủy phõn và hoạt tính vọ̃n chuyờ̉n nhóm. Nó khụng những thủy phõn maltose thành glucose mà còn tụ̉ng hợp nờn izomaltose, izotriose. Tức là khả năng chuyờ̉n gụ́c glucose đờ́n gắn nó vào phõn tử maltose hoặc gắn vào mụ̣t phõn tử glucose khác bằng liờn kờ́t α-1-6-glucoside đờ̉ tạo thành các phõn tử nói trờn.
Sự có mặt của các enzyme này trong các chờ́ phõ̉m enzyme amylase dùng đờ̉ biờ́n hình tinh bụ̣t là điờ̀u khụng mong muụ́n, vì nó xúc tác sự tụ̉ng hợp lại các izosaccharid từ chính các sản phõ̉m thủy phõn tinh bụ̣t. Vì vọ̃y làm giảm hiợ̀u suṍt đường hóa, các sản phõ̉m thủy phõn có vị đắng khụng mong muụ́n.
2-Cỏc loại vi sinh vật cú khả năng tổng hợp amylase cao
Hiợ̀n nay người ta biờ́t được nhiờ̀u loại vi sinh vọ̃t có khả năng tụ̉ng hợp amylase cao, những vi sinh vọ̃t này được phõn lọ̃p chủ yờ́u từ mụi trường tự nhiờn.
Hợ̀ enzyme amylase của mụ̃i loài vi sinh vọ̃t khác nhau là khụng giụ́ng nhau, tỉ lợ̀ giữa các loại enzyme trong hợ̀ khác nhau.
Bằng phương pháp cải tạo giụ́ng hiợ̀n nay người ta thu được các chủng có khả năng tụ̉ng hợp nhiờ̀u amylase và enzyme có khả năng chịu nhiợ̀t, các chủng này sử dụng trong sản xuṍt chờ́ phõ̉m thương mại.
Bảng4.2 giới thiợ̀u mụ̣t sụ́ chủng vi sinh vọ̃t được sử dụng đờ̉ thu amylase.
Bảng 4.2. Một số vi sinh vật sinh amylase cao
Nấm sợi Nấm men Vi khuẩn
Aspergillus oryzae Aspergillus niger Aspergillus usamii Aspergillus awamori Aspergillus batatae Saccharomyces Candida Endomycopsis Endomyces Bacillus subtilis Bacillus diastasa Bacillus coagulans Bacillus circulans Bacillus diastaticus
Hợ̀ amylase của nṍm mụ́c thường chứa chủ yờ́u α-amylase, glucoamylase và transglucosylase. Aspergillus oryzae tạo nhiờ̀u α-amylase, nhưng ít transglucosylase,
Aspergillus awamori, Aspergillus niger tạo nhiờ̀u glucoamylase nhưng ít α-amylase. Vi khuõ̉n có khả năng sinh trưởng và phát triờ̉n mạnh và tụ̉ng hợp nhiờ̀u amylase, từ mụ̣t sụ́ loài vi khuõ̉n ưa nhiợ̀t như Bacillus circulans, Bacillus diastaticus
3-Nuụi nấm sợi trờn mụi trường rắn đờ̉ thu amylase
Thành phõ̀n mụi trường và điờ̀u kiợ̀n nuụi vi sinh vọ̃t đóng vai trò hờ́t sức quan trọng, có tính chṍt quyờ́t định cho lượng enzyme sinh ra. Các nṍm sợi như Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, vv... là những chủng hay dùng đờ̉ thu enzyme.
Cấu tử chớnh của mụi trường: Mụi trường sử dụng trong nuụi nṍm sợi trờn mụi trường rắn đờ̉ thu amylase là cám gạo, cám mì. Cám gạo có khoảng 20% tinh bụ̣t, 10-15% chṍt bộo, 10-14% protein, và các chṍt khác như cellulose, khoáng chṍt, vitamin, vv... Cỏm mỡ cú 16-22%, tinh bụ̣t cú 10-12% protein, trong đó có các axit amin cõ̀n thiờ́t cho vi sinh vọ̃t phát triờ̉n, 3-4% chṍt bộo, và các thành phõ̀n khác như khoáng chṍt, vitamin vv... Chṍt lượng của cám gạo, cám mì ảnh hưởng tới hoạt lực của enzyme amylase sinh ra. Ngoài ra, người ta còn bụ̉ sung thờm mụ̣t sụ́ thành phõ̀n khác đờ̉ tăng dinh dưỡng như nước chiờ́t mõ̀m lúa mạch, cao nṍm men hay đờ̉ tăng đụ̣ xụ́p người ta có thờ̉ bụ̉ sung thờm trṍu, mùn cưa.
Độ ẩm của mụi trường: Đụ̣ õ̉m mụi trường nuụi khoảng 50-60%, đụ̣ õ̉m tăng quá 70% sẽ làm giảm đụ̣ thoáng khí của mụi trường còn nờ́u thṍp hơn 50% sẽ kìm hãm sự phát triờ̉n và khả năng tạo enzyme của nṍm sợi. Đụ̣ õ̉m mụi trường phải ụ̉n định trong suụ́t thời gian nuụi.
Cõ̀n thụng khí liờn tục trong suụ́t thời kỳ sinh trưởng của nṍm sợi. Chờ́ đụ̣ thụng khí có thờ̉ liờn tục hay gián đoạn tùy thuụ̣c vào chiờ̀u dày của mụi trường nuụi và khoảng cách bụ́ trí giữa các khay.
Nhiệt độ nuụi: Nhiợ̀t đụ̣ nuụi tùy thuụ̣c vào chủng loại vi sinh vọ̃t. Đờ̉ giữ cho nhiợ̀t đụ̣ phòng nuụi ụ̉n định cõ̀n hiờ̉u rừ đặc điờ̉m sinh lý của chúng. Đụ́i với nṍm mụ́c chu kỳ sinh trưởng trờn mụi trường rắn có thờ̉ chia làm 3 thời kỳ sau:
- Thời kỳ nảy mõ̀m của bào tử (khoảng 10ữ11 giờ đõ̀u tiờn), trong thời kỳ này phòng nuụi phải giữ đụ̣ õ̉m cao và nhiợ̀t đụ̣ duy trì ở 32ữ38ºC.
- Thời kỳ sinh trưởng của hợ̀ sợi, kộo dài khoảng 4ữ18 giờ. Thời kỳ này nṍm hụ hṍp mạnh nờn tỏa nhiờ̀u nhiợ̀t dõ̃n đờ́n làm tăng nhiợ̀t đụ̣ ở phòng nuụi, vỡ vọ̃y, cõ̀n có chờ́ đụ̣ bình ụ̉n nhiợ̀t đờ̉ khụng làm phòng nuụi tăng nhiợ̀t.
- Thời kỳ tạo enzyme mạnh, kộo dài khoảng 10ữ20 giờ. Ở thời kỳ này, quỏ trỡnh trao đụ̉i chṍt giảm dõ̀n, sự tỏa nhiợ̀t cũng giảm. Đụ́i với đa sụ́ vi sinh vọ̃t thì giai đoạn này nờn hạ nhiợ̀t đụ̣ thṍp hơn giai đoạn đõ̀u 3ữ4ºC. Kờ́t quả nghiờn cứu cho thṍy lượng enzyme sinh ra ở những ngày đõ̀u rṍt ít, nhưng ở các giai đoạn sau sự tụ̉ng hợp enzyme ngày mụ̣t mạnh thờm.
Thời gian nuụi: Thời gian nuụi đờ̉ cú thờ̉ thu enzyme cao nhṍt phải được xác định bằng thực nghiợ̀m trờn mụi trường và điờ̀u kiợ̀n nuụi cụ thờ̉. Đụ́i với nṍm mụ́c
Aspergillus thì sự tạo enzyme cực đại thường kờ́t thúc khi nṍm bắt đõ̀u sinh bào tử. Trong điờ̀u kiợ̀n thoáng khí tụ́t thì thời gian nuụi Aspergillus oryzae 476 là 24ữ25 giờ,
Aspergillus oryzae 8F1 là 30ữ36 giờ, và Aspergillus awamori là 36 giờ. Thời gian nuụi phải được xác định cho mụ̃i chủng trong từng điờ̀u kiợ̀n cụ thờ̉.
4-Nuụi vi sinh vật trờn mụi trường lỏng đờ̉ thu amylase
Hõ̀u hờ́t các loại vi sinh vọ̃t đờ̀u có thờ̉ nuụi trong mụi trường lỏng. Hiợ̀n nay, nhiờ̀u loại thiờ́t bị lờn men được thiờ́t kờ́ phù hợp cho viợ̀c nuụi các loại vi sinh vọ̃t. Trong phõ̀n này chỉ trình bày chủ yờ́u là nuụi vi khuõ̉n đờ̉ thu amylase.
Mụ̣t sụ́ vi khuõ̉n sử dụng làm nguụ̀n thu enzyme amylase như: Bacillus subtilis, Clostridium pasterianum, Bacillus diastaticus, vv... Ở Anh, Pháp, Đan Mạch, Nhọ̃t Bản người ta dùng Bacillus subtilis làm nguụ̀n thu amylase chính.
Mụi trường nuụi: Cṍu tử chính của mụi trường nuụi Bacillus subtilis là bụ̣t ngụ. Ngoài ra, người ta còn có thờ̉ bụ̉ sung mụ̣t sụ́ chṍt hiợ̀p trợ khác như: Lactose, K2SO4, NaCl, MgSO4. Có thờ̉ nuụi Bacillus subtilis bằng nước chiờ́t cám 20% hay bằng mụi trường Namura cải tiờ́n, có các thành phõ̀n sau: 2% tinh bụ̣t; 0,067M (NH4)2HPO4 ; 0,2M KCl; 0,002M MgSO4.7H2O; 0,001M CaCl2 và dịch chiờ́t đọ̃u nành 5%; pH mụi trường 7,2. Vṍn đờ̀ chọn thành phõ̀n mụi trường đờ̉ thu lượng enzyme cao là rṍt quan trọng, do vọ̃y cõ̀n khảo sát cụ thờ̉ cho từng trường hợp cụ thờ̉. Amylase là loại enzyme được tụ̉ng hợp theo cơ chờ́ cảm ứng nờn trong mụi trường phải có thành phõ̀n tinh bụ̣t.
Nhiệt độ nuụi: Nhiợ̀t đụ̣ nuụi ảnh hưởng đờ́n khả năng sinh sản, phát triờ̉n và
tụ̉ng hợp enzyme ở vi sinh vọ̃t. Khụng tuõn thủ đõ̀y đủ chờ́ đụ̣ nhiợ̀t đụ̣ sẽ dõ̃n đờ́n làm giảm hoạt lực enzyme. Đụ́i với Bacillus subtilis thì nhiợ̀t đụ̣ nuụi thích hợp là 37o
C. Nhiợ̀t đụ̣ nuụi ảnh hưởng rṍt lớn đờ́n đụ̣ bờ̀n nhiợ̀t của enzyme tạo thành. Ví dụ nuụi
Bacillus coagulans ở 35o
C và 55oC thỡ enzyme amylase sinh ra có khả năng chịu nhiợ̀t khỏc nhau. Enzyme amylase thu nhọ̃n ở trường hợp nuụi ở 35oC bị mṍt 90 ữ94% hoạt tính khi giữ ở 90oC trong mụ̣t giờ, trong lúc đó, enzyme amylase thu nhọ̃n ở trường hợp nuụi ở 55oC chỉ bị mṍt hoạt tính có 12%.
Sục khớ và khuấy trộn: Đụ́i với vi sinh vọ̃t hiờ́u khí thì viợ̀c sục khí và khuṍy
trụ̣n là hờ́t sức cõ̀n thiờ́t. Ví dụ đụ́i với vi khuõ̉n Bacillus subtilis, nuụi ở thùng lờn men nhõn giụ́ng có cánh khuṍy làm viợ̀c liờn tục, lượng khí vụ trùng sục vào mụi trường với lưu lượng 40m3
khớ/1m3 mụi trường/giờ, còn nuụi ở thùng lờn men sản xuṍt enzyme thì cánh khuṍy cũng phải làm viợ̀c liờn tục và lưu lượng khí sục vào mạnh hơn 60m3 khớ/1m3 mụi trường/giờ. Chờ́ đụ̣ sục khí tùy thuụ̣c vào loài vi sinh vọ̃t và nó ảnh hưởng rṍt lớn đờ́n lượng enzyme sinh ra.