Thu nhận protein bằng phương phỏp thủy phõn

- Chất mang là polymer tổng hợp hóa học:

5. SẢN XUẤT PROTEIN 1 Sản xuất insulin

5.2.3. Thu nhận protein bằng phương phỏp thủy phõn

Dưới tác đụ̣ng của các tác nhõn thủy phõn, mạch phõn tử protein bị bẻ gãy. Tùy mức đụ̣ thủy phõn mà thành phõ̀n các chṍt trong sản phõ̉m có thay đụ̉i. Nờ́u thủy phõn sõu thì sản phõ̉m sẽ có thành phõ̀n axit amin cao, các oligopeptid và peptid ngắn, sản phõ̉m tan tụ́t trong nước. Mức đụ̣ thủy phõn càng nhiờ̀u thì đụ̣ tan của sản phõ̉m càng cao. Tuy nhiờn khi mức đụ̣ tan càng cao thì những tính chṍt chức năng ban đõ̀u (tạo gel, tạo bọt, tạo nhũ...) của protein càng giảm.

Có 2 cách thủy phõn: thủy phõn hóa học và thủy phõn bằng enzyme

a. Phương phỏp thủy phõn húa học

Cơ chờ́ của phương pháp này là dùng hoá chṍt đờ̉ thuỷ phõn protein đờ́n sản phõ̉m cuụ́i cùng là axit amin. Thủy phõn bằng tác nhõn hóa học được sử dụng sớm hơn tỏc nhõn enzyme. Tác nhõn thủy phõn có thờ̉ axit hoặc kiờ̀m, thường sử dụng HCl, H2SO4 hoặc NaOH, Na2CO3 nhiợ̀t đụ̣ thủy phõn 100 oC dưới áp suṍt (có thờ̉ khụng). Thủy phõn bằng HCl có ưu điờ̉m hơn các hóa chṍt khác do màu của dịch thuỷ phõn sỏng, đạm thụ́i ít và sự tụ̉n thṍt axit amin cũng ít, bờn cạnh đó sau khi thủy phõn, trung hòa lại bằng NaOH sẽ tạo muụ́i NaCl, là chṍt vừa tạo vị vừa có chức năng bảo quản. Nờ́u dùng H2SO4 thuỷ phõn thì nhanh hơn dùng HCl, giá thành tương đương, nhưng màu dịch đạm đen hơn nhiờ̀u, có nhiờ̀u đạm thụ́i. Dùng NaOH thuỷ phõn thì giá trị dinh dưỡng sản phõ̉m bị thay đụ̉i, đụ̀ng thời cũng bị mṍt đi mụ̣t sụ́ axit amin. Còn dùng Na2CO3 thì tụ́t đụ̣ thủy phõn chọ̃m, đụ̀ng thời tiờu tụ́n lượng axit lớn hơn lượng Na2CO3đờ̉ trung hoà dung dịch thuỷ phõn.

Khi thủy phõn bằng axit, có nhược điờ̉m là mụ̣t sụ́ axit amin giải phóng ra sẽ bị phá hủy, cụ thờ̉ như triptophan bị phá hủy hoàn toàn, các axit amin có các nhóm chức - OH, -SH... cũng bị phá hủy mụ̣t phõ̀n.

Khi thủy phõn bằng tác nhõn kiờ̀m (NaOH) cũng làm cho cysteine, arginine, methionine bị phá hủy. Mặt khác khi thủy phõn bằng kiờ̀m sẽ làm các axit amin giải phóng ra chuyờ̉n từ dạng đụ̀ng phõn L sang dạng D (raxemic hóa), là dạng mà cơ thờ̉ người khụng hṍp thụ được, làm giảm giá trị dinh dưỡng. Những năm gõ̀n đõy xu hướng chuyờ̉n phương pháp thủy phõn bằng hóa học sang thủy phõn bằng enzyme.

Nhược điờ̉m lớn nhṍt của phương pháp thủy phõn hóa học thường sản phõ̉m có sự thay đụ̉i mùi, vị.

Dựa vào nguụ̀n cung cṍp enzyme người ta phõn biợ̀t 2 kiờ̉u thủy phõn: tự phõn và thủy phõn bằng chờ́ phõ̉m enzyme

- Tự phõn: là trường hợp quá trình phõn giải protein do enzyme protease của chính nguụ̀n nguyờn liợ̀u. Các enzyme thủy phõn có sẵn trong nguyờn liợ̀u cá, như pepsine, tripsine, chymotripine trong ruụ̣t cá, các protease trong cơ thịt cá vv...

Tự phõn là phương pháp được áp dụng trong các cụng nghợ̀ sản xuṍt thức ăn truyờ̀n thụ́ng như nước mắm của Viợ̀t Nam, nam-pla của Thái lan, shiokara của Nhọ̃t. Những sản phõ̉m loại này ban đõ̀u nguyờn liợ̀u được bảo quản trong muụ́i ở nụ̀ng đụ̣ cao.

- Thủy phõn bằng chờ́ phõ̉m enzyme

Là trường hợp phải sử dụng chờ́ phõ̉m enzyme bụ̉ sung vào nguyờn liợ̀u đờ̉ thủy phõn và giữ vai trò chính. Trong mụ̣t sụ́ trường hợp có thờ̉ kờ́t hợp với enzyme có sẵn trong nguyờn liợ̀u, nhưng cũng có trường hợp người ta vụ hoạt các enzyme trong nguyờn liợ̀u trước khi bụ̉ sung enzyme. Thành phõ̀n hóa học của sản phõ̉m thủy phõn phụ thuụ̣c vào nguụ̀n enzyme, vì mụ̃i enzyme có khả năng và vị trí thủy phõn đặc trưng. Ví dụ khi sử dụng pepsine đờ̉ thủy phõn thì sản phõ̉m thường có vị đắng vỡ trong sản phõ̉m xuṍt hiợ̀n những peptid đắng, cũn khi dựng enzyme subtilisine (protease của vi sinh vọ̃t) thì sản phõ̉m khụng bị đắng, chṍt lượng (đụ̣ tan, thành phõ̀n axit amin...) cao hơn. Chṍt lượng của sản phõ̉m thu nhọ̃n khụng những phụ thuụ̣c vào bản chṍt của enzyme mà còn phụ thuụ̣c vào điờ̀u kiợ̀n thủy phõn như pH, nhiợ̀t đụ̣, nụ̀ng đụ̣ enzyme.

Bảng 4.6. pH và nhiệt độ tối thớch của một số enzyme sử dụng để sản xuất protein hydrrolysed từ cỏ

Enzyme pH tối thớch Nhiệt độ tối thớch

Tripsine Pepsine Pacreatine 7,5 2,0 7,5 40 50 40 Papaine Ficine Bromelaine 6,5 6,0 6,0 65 40 50 Pronase 7,5 50

Qui trình sản xuṍt chờ́ phõ̉m protein thủy phõn có các cụng đoạn chính sau đõy: 1- Nghiờ̀n nhỏ nguyờn liợ̀u đờ̉ tăng hiợ̀u quả thủy phõn.

2- Bụ̉ sung enzyme và nước.

3- Điờ̀u chỉnh pH, nhiợ̀t đụ̣ thủy phõn thích hợp.

4- Thực hiợ̀n thủy phõn trong khoảng thời gian đã chọn.

5- Dừng quá trình thủy phõn bằng cách gia nhiợ̀t nhanh đờ́n 100 o

C. 6- Loại xương và các phõ̀n phụ bằng phương pháp rõy.

7- Ly tõm lõ̀n thứ nhṍt đờ̉ thu phõ̀n thịt mịn khụng tan.

8- Dịch ly tõm lõ̀n thứ 1 đem ly tõm lõ̀n thứ 2 đờ̉ tách chṍt bộo.

9- Trụ̣n phõ̀n thịt mịn thu được ở lõ̀n ly tõm 1 với phõ̀n dịch đã tách bộo ở lõ̀n ly tõm 2 đem cụ đặc và sṍy khụ.

Các cụng đoạn trong qui trình có thờ̉ có thay đụ̉i trong những trường hợp sản xuṍt cụ thờ̉, ví dụ cụng đoạn nghiờ̀n nhỏ nguyờn liợ̀u ban đõ̀u có thờ̉ khụng thực hiợ̀n, thay vào đó là quá trình xử lý nhiợ̀t đờ̉ tiờu diợ̀t vi sinh vọ̃t, vụ hoạt các enzyme trong nguyờn liợ̀u, làm biờ́n tính protein đờ̉ tăng khả năng thủy phõn. Cách xử lý này tạo điờ̀u kiợ̀n cho enzyme thủy phõn đưa vào thực hiợ̀n quá trình phõn giải, sản phõ̉m thu nhọ̃n có định hướng và chṍt lượng cao hơn là trường hợp chỉ nghiờ̀n mà khụng gia nhiợ̀t.

Sản phõ̉m protein thủy phõn có tính tan tụ́t, nờ́u có cụng đoạn khử mùi tụ́t thì sản phõ̉m có thờ̉ sử dụng được trong sản xuṍt các sản phõ̉m dinh dưỡng dạng lỏng, và bụ̉ sung vào nhiờ̀u qui trình sản xuṍt nhằm tăng hàm lượng protein trong sản phõ̉m.

c. Phương phỏp thủy phõn kết hợp

Đõy là phương pháp được thạc sĩ Đặng Thị Mụ̣ng Quyờn thực hiợ̀n năm 2005 với nguyờn liợ̀u ban đõ̀u là phờ́ liợ̀u thu được sau cụng đoạn fillet của các xí nghiợ̀p sản xuṍt cá đụng lạnh xuṍt khõ̉u.

Quá trình thủy phõn được thực hiợ̀n 2 bước, đõ̀u tiờn thủy phõn bằng enzyme sau đó bằng axit. Qui trình sản xuṍt đạm thủy phõn được thực hiợ̀n theo sơ đụ̀ hình 4.22. Trong qui trình này có bước cải tiờ́n là khụng sử dụng dạng chờ́ phõ̉m enzyme tinh khiờ́t mà sử dụng vi khuõ̉n Bacillus subtilis là mụ̣t loại vi khuõ̉n khụng có đụ̣c tụ́, an toàn cho người và gia súc, có khả năng tụ̉ng hợp protease cao. Vi khuõ̉n được đưa vào trực tiờ́p, và trong quá trình hoạt đụ̣ng vi khuõ̉n sẽ sản sinh enzyme thủy phõn protein, làm đứt liờn kờ́t giữa protein và xương đờ̉ dờ̃ dàng tách xương và thu nhọ̃n protein. Các thụng sụ́ kỹ thuọ̃t cụ thờ̉ của quá trình được trình bày tại bảng 4.7.

Bảng 4.7. Cỏc thụng số kỹ thuật của qui trỡnh sản xuất đạm thuỷ phõn từ cỏ phế liệu

STT Cụng đoạn Thụng số kỹ thuật

1 Xử lý mõ̃u - - Trụ̣n đờ̀u nguyờn liợ̀u Bao gói và bảo quản ở -30o

C 2 Xay ( cá phờ́ liợ̀u ) Sử dụng máy xay thụ, ∅ = 3 - 5mm 3 Nuụi cṍy chìm Bacillus

subtilis

Mụi trường: pepton, bụ̣t cá, tinh bụ̣t tan 0,5% NaCL

4 Phụ́i trụ̣n Muụ́i tinh: 3% ; Nước: 30% Dịch canh trường: 20% 5

Thuỷ phõn bằng enzyme Nhiợ̀t đụ̣ : 50Thời gian: 8 giờ, khuṍy đảo liờn tục oC; pH = 6,5 6 Thuỷ phõn bằng axit Nhiợ̀t đụ̣ 90

o

C

Dùng HCl 7N điờ̀u chỉnh pH dịch cá = 4 Thời gian 2 giờ; khuṍy đảo liờn tục 7 Trung hoà Na2CO3 20% , pH = 6,5

8 Đun sụi Nhiợ̀t đụ̣ 100oC, thời gian 10 phút 9 Lọc xương Sử dụng rõy lọc có ∅ = 1mm

10 Cụ đặc Nụ̀i cụ đặc có cánh khuṍy, cụ ở áp suṍt thường Nhiợ̀t đụ̣: 80oC ; Thời gian: 1 giờ Nụ̀ng đụ̣ chṍt khụ: 30o

Bx

11 Xay nhuyờ̃n Dùng máy xay, xay đờ́n khi dịch nhuyờ̃n, mịn, đụ̀ng nhṍt 12 Sṍy ( xương ) Nhiợ̀t đụ̣: 70oC ; Thời gian: 4 - 5 giờ

Đụ̣ õ̉m : 16%

Cá phờ́ liợ̀u Bacillus subtilis

Xử lý mõ̃u Nuụi cṍy chìm

Xay Dịch canh trường

Muụ́i Phụ́i trụ̣n ( pH=6,5 ) Thuỷ phõn bằng enzyme Axớt Điờ̀u chỉnh pH ( pH=4 )

Thuỷ phõn bằng axit Trung hoà Đun sụi Xay nhuyờ̃n Cụ đặc Sản phẩm dịch cao đạm Lọc xương

Dịch lọc xương

Sṍy Xay mịn

Sản phẩm phụ:

Bột xương

Nước

Sản phõ̉m được hướng vào sử dụng trong sản xuṍt thức ăn cho nuụi trụ̀ng thủy sản. Sau thủy phõn dịch đạm có nụ̀ng đụ̣ chṍt khụ thṍp, hàm lượng chṍt dinh dưỡng nhiờ̀u nờn dờ̃ bị hư hỏng trong thời gian ngắn. Tác giả đã tiờ́n hành cụ đặc và thu nhọ̃n sản phõ̉m ở dạng põte đờ̉ có thờ̉ bảo quản dài, các bước tiờ́n hành như sau:

- Sau 10 giờ thuỷ phõn bằng enzyme – axit và trung hoà bằng Na2CO3 20% thỡ dung dịch được đem đun sụi ở 100oC trong thời gian 10 phút. Quá trình đun sụi giúp vụ hoạt enzyme, loại mùi tanh, đụ̀ng thời, ở nhiợ̀t đụ̣ này đụ̣ nhớt của dung dịch giảm, quá trình lọc xương sau này cũng thuọ̃n lợi hơn. Cụ đặc trực tiờ́p ở nhiợ̀t đụ̣ 80o

C trong thời gian 1 giờ, khuṍy đảo liờn tục. Nờ́u chọn nhiợ̀t đụ̣ cụ đặc cao hơn thì trong quá trình cụ đặc dung dịch dờ̃ bị cháy, nhṍt là ở giai đoạn cuụ́i. Còn nờ́u nhiợ̀t đụ̣ thṍp hơn thì thời gian cụ đặc lõu. Khi dung dịch đạt nụ̀ng đụ̣ khoảng 300Bx thì dừng quá trình cụ đặc. Có thờ̉ cụ đặc bằng phương pháp cụ quay chõn khụng. Sau khi cụ đặc, đờ̉ nguụ̣i dung dịch, thực hiợ̀n đụ̀ng hóa sản phõ̉m. Sản phõ̉m đem kiờ̉m tra các chỉ tiờu chṍt lượng. Ngoài sản phõ̉m protein dạng põte còn có sản phõ̉m phụ là bụ̣t xương, có thờ̉ sử dụng đờ̉ sản xuṍt thức ăn cho gia cõ̀m.