Xỏc định hoạt độ enzyme protease (phương phỏp Anson)

- O CH2 COOH phõn ly

5. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME 1 Nguyờn tắc chung

5.3.1. Xỏc định hoạt độ enzyme protease (phương phỏp Anson)

a. Nguyờn tắc:

Cho protease tác dụng với cơ chṍt là casein (hoặc hemoglobin), sản phõ̉m tạo thành là các peptid ngắn hay acid amin, trong các loại acid amin, tyrosine chiờ́m đa sụ́. Xác định tyrosine bằng phản ứng màu với thuụ́c thử folin , từ đó xác định hoạt đụ̣ enzyme protease theo định nghĩa:

Hỡnh 3.6. Mụ hỡnh hoạt động của enzyme protease

Hoạt đụ̣ của protease được biờ̀u thị là sụ́ micromole tyrosine sinh ra do thuỷ phõn Casein bởi 1ml dung dịch hay 1 mg hụ̃n hợp chứa protease trong 1 phút ở điờ̀u kiợ̀n chuõ̉n (35,50

C, pH 7.6)

b. Hoỏ chất:

- Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hoà tan 5,96g Na2HPO4.12H2O trong nước thành 250 ml

- Dung dịch KH2PO4 1/15M: hoà tan 0,9072g KH2PO4trong nước thành 100ml - Dung dịch đợ̀m Sorensen 1/15M, pH 7.6: trụ̣n 177ml dung dịch Na2HPO4 1/15Mvà 23 ml dung dịch KH2PO4. đo và chỉnh lại pH cho đúng.

- Dung dịch Casein 1%: đun sụi cách thuỷ 1g casein trong đợ̀m Sorensen đờ́n tan hoàn toàn rụ̀i sau đó định mức bằng Sorensen cho đủ 100ml.

- Dung dịch TCA (tricloro acid) 10%: hoà tan 10g TCA trong nước cho đủ 100ml - Dung dịch NaOH 0,5N: hoà tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500 ml

- Dung dịch tyrosin 20mM/l: khuṍy nghiờ̀n 0,118 g tyrosin trong dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 50ml

- Dung dịch tyrosin chuõ̉n 1mM/l: pha loãng 5 ml tyrosine 20mM/l trong HCl 0,2N thành 100 ml

c. Tiến hành thớ nghiệm:

Trước hờ́t cõ̀n xõy dựng đường chuõ̉n Tyrosine theo các nụ̀ng đụ̣ được trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3.4. Dựng đường chuẩn tyrosin

ễ́ng nghiợ̀m 0 1 2 3 4 5

Dung dịch tyrosin chuõ̉n 1mM/l 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Dung dịch HCl 0,2N (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 2 2 2 2 Thuụ́c thử Folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Lượng tyrosin (micromol) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Lắc và đờ̉ yờn 10 phút đem đo mọ̃t đụ̣ quang ở bước sóng 660 nm

Vẽ đụ̀ thị biờ̉u diờ̃n sự biờ́n thiờn mọ̃t đụ̣ quang (OD) theo lượng tyrosin ở các ụ́ng.

Bảng 3.5. Xỏc định lượng tyrosin trong dung dịch nghiờn cứu

Dung dịch hoá chṍt ễ́ng nghiợ̀m

Thử thọ̃t (3 ụ́ng) Thử khụng (3 ụ́ng)

Casein 1% (ml) 5 5

TCA 10% (ml) 0 5

Dịch enzyme mõ̃u (ml) 1 0

Lắc đều và giữ ở 35,5o

C, trong 30 phỳt

TCA 10% (ml) 5 0

Dịch enzyme mõ̃u (ml) 0 1

Lọc, lṍy 1ml dịch lọc thực hiợ̀n phản ứng màu

Dịch lọc (ml) 1 1

Dung dịch NaOH 0.5N (ml) 2 2

Thuụ́c thử Folin (ml) 0,6 0,6

Lắc đều, để yờn 10 phỳt, đo OD ở bước súng 660 nm d. Cỏch tớnh: Hoạt đụ̣ protease: HT (UI) = v t K V x . . .

x: sụ́ à mol tyrosin suy ra từ đường chuõ̉n

v: thờ̉ tích dịch lọc đem phõn tích (1ml)

K: đụ pha loãng mõ̃u

t: thời gian phản ứng (30 phút)

1 UI (Anson) = 1 micromol Tyrosine/ml/phỳt ; hoặc = 1 micromol/mg/phút