- O CH2 COOH phõn ly
5.2.Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme
5. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME 1 Nguyờn tắc chung
5.2.Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme
Viợ̀c xác định hoạt đụ̣ của enzyme thường được các nhà khoa học đưa ra những phương pháp rṍt cụ thờ̉ , ứng với từng loại cơ chṍt . Các phương pháp các định hoạt đụ̣ enzyme chủ yờ́u dựa vào hai cách phõn tích phản ứng enzyme, đó là phõn tích lien tục và phõn tích gián đoạn.
a. Phõn tớch liờn tục là phương pháp đo cơ chṍt bị biờ́n đụ̉i hay sản phõ̉m tạo thành mụ̣t cách liờn tục theo thời gian , ví dụ như cách đo hoạt đụ̣ của NADH oxidase (NOX) qua phản ứng: NADH + H+
+ O2 NAD+ + H2O2 (do enzyme NOX sinh H2O2 xỳc tỏc)
2NADH + 2H+ + O2 2NAD+ + 2H2O (do enzyme NOX sinh H2O xỳc tỏc) Dựa vào sự hṍp thụ ánh sáng của NADH ở bước sóng 340nm, người ta có thờ̉ tiờ́n hành phản ứng trong mụ̣t cuvet và đo sự biờ́n đụ̉i của NADH bằng quang phụ̉ kờ́
theo thời gian ngay từ khi bụ̉ sung enzyme vào dung dịc h phản ứng có chứa sẵn cơ chṍt, hay bụ̉ sung cơ chṍt vào hụ̃n hợp phản ứng đã chứa sẵn enzyme. Phương pháp liờn tục thường được sử dụng khi khụng có cơ chṍt hay cách làm ngừng phản ứng thích hợp, hoặc được áp dụng với mụ̣t sụ́ enzyme dờ̃ bị mṍt hoạt tính xúc tác ở điờ̀u kiợ̀n phõn tích. Ngoài ra, các phương pháp phõn tích liờn tục còn được dùng phụ̉ biờ́n với các nghiờn cứu hoạt đụ̣ng enzyme. Tuy nhiờn, yờu cõ̀u đụ́i với thiờ́t bị đo là phải có bụ̣ phọ̃n ụ̉n nhiợ̀t đờ̉ phản ứng được thực hiợ̀n ở các nhiợ̀t đụ̣ mong muụ́n . Đõy cũng là mụ̣t hạn chờ́ của phương pháp . Ngoài ra, do phải theo dừi sự biờ́n đụ̉i của chṍt phản ứng mụ̣t cách liờn tục nờn khó có thờ̉ thực hiợ̀n phõn tích hoạt đụ̣ của nhiờ̀u mõ̃u enzyme trong cùng mụ̣t lúc.
b. Phõn tớch giỏn đoạn là phương pháp cho enzyme tác dụng với cơ chṍt sau mụ̣t khoảng thời gian nhṍt định thì làm ngừ ng phản ứng enzyme bằng cách thích hợp và sau đó đo lượng cơ chṍt còn lại hoặc sản phõ̉m tạo thành. Đõy là cách được sử dụng phụ̉ biờ́n nhṍt trong các phõn tích hoạt đụ̣ enzyme hiợ̀n nay.
Đờ̉ làm ngừng phản ứng enzyme cú thờ̉ dùng các tác nhõn làm bṍt hoạt enzyme như nhiợ̀t đụ̣ cao, thay đụ̉i pH (bụ̉ sung acid hoặc kiờ̀m), dùng chṍt tạo phức hay tách enzyme ra khỏi hụ̃n hợp phản ứng v .v… phương pháp này khắc phục được những hạn chờ́ của phương pháp đo liờn tục , phản ứng có thờ̉ tiờ́n hành trong tủ ṍm hay bờ̉ ụ̉n nhiợ̀t, có thờ̉ tiờ́n hành mụ̣t lúc nhiờ̀u mõ̃u … Tuy vọ̃y , vṍn đờ̀ là phải tìm ra cách làm ngừng phản ứng thích hợp.
Dựa theo nguyờn tắc xác định hoạt đụ̣ enzyme, bằng cách đo lien tục hay gián đoạn, hoạt đụ̣ enzyme có thờ̉ được xác định theo mụ̣t hay mụ̣t sụ́ phương pháp chính sau đõy:
- Phương phỏp đo độ nhớt:Sử dụng nhớt kờ́ đờ̉ đo sự biờ́n đụ̉i đụ̣ nhớt của dung dịch phản ứng. Phương pháp được áp dụng với các enzyme mà cơ chṍt có đụ̣ nhớt cao hơn hẳn so với sản phõ̉m , thường là các cơ chṍt có khụ́i lượng phõn tử lớn như các acid nucleic, protein…
- Phương phỏp phõn cực kế: Sử dụng khi cơ chṍt và sản phõ̉m c ó khả năng làm quay mặt phẳng phõn cực ánh sáng và có góc quay riờng khác nhau , ví dụ cho phản ứng phõn giải sucrose bởi enzyme invertase. Sucrose có đụ̣ quay mặt phẳng phõn cực là +650, còn đụ́i với glucose là +52,50
, trong khi của fructose là -92,40
. Chính vì vọ̃y sản phõ̉m tạo thành sẽ làm giảm mức đụ̣ quay mặt phẳng ánh sáng phõn cực , từ phải sang trỏi.
- Phương phỏp đo ỏp suất hay ỏp kế : Chỉ dùng với các phản ứng enzyme có sự tiờu hao hay sinh khớ, ví dụ như các phản ứng oxi hóa , decarboxyl húa, loại amin hóa. Phản ứng sinh hay tiờu hao khí có thờ̉ trực tiờ́p hay gián tiờ́p. Ví dụ lipid với sự xúc tác của lipase tạo ra glycerol và các acid bộo , cỏc acid bộo khi cú m ặt của NaHCO3 sẽ tạo ra CO2hay có sự loại amin do có sự tác dụng của các amino acid với HNO2tạo N2 bay ra
- Phương phỏp quang phổ kế : Được sử dụng rṍt phụ̉ biờ́n , dựa trờn khả năng hṍp thụ ánh sáng ở các bước sóng xác đị nh của cơ chṍt , hoặc sản phõ̉m phản ứng . Vớ dụ: với enolase có thờ̉ đo sản phõ̉m phosphoenolpyruvate (PEP) tạo thành bằng cách đo đụ̣ hṍp thụ của PEP ở bước sóng 240nm. Còn với enzyme lactate dehydrogenase xúc tác cho phản ứng k hử pyruvate thành lactate thì có thờ̉ đo sự biờ́n đụ̉i của NADH qua sự hṍp thụ ở bước sóng 340nm.
-Phương phỏp chuẩn độ : Dùng cho sự phản ứng enzyme có sự hình thành acid hoặc base. Phương pháp yờu cõ̀u giữ pH mụi trường cụ́ đị nh, lượng kiờ̀m hoặc acid chuõ̉n dùng đờ̉ chuõ̉n đụ̣ theo thới gian phản ánh hoạt đụ̣ enzyme.
- Phương phỏp sắc ký: Sử dụng sắc ký đờ̉ phõn tích sản phõ̉m phản ứng , ví như tỏch amino acid sau khi cho hai enzyme aminotranpherase lờn cơ chṍt protease tác dụng lờn cơ chṍt và sau đó định lượng các amino acid thu được . Đõy là phương pháp tụ́n thời gian nờn ít được sử dụng.
- Phương phỏp húa học: Dùng các phản ứng hóa học đờ̉ định lượng cơ chṍt mṍt đi hay lượng sản phõ̉m tạo thành . Thụng thường phải tạo phản ứng tạo nờn các phức chṍt màu có đụ̣ hṍp thu ánh sáng cực đại ở vùng nào đó đờ̉ từ đó định lượng hợp chṍt này. Ví dụ trong phản ứng thủy phõn tinh bụ̣t bởi α-amylase:
Tinh bụ̣t Dextrin
Đờ̉ đo hoạt đụ̣ của amylase , có thờ̉ dùng I2 tác dụng với dung dịch tinh bụ̣t , sau đó đo cường đụ̣ màu xanh tím tạo thành đờ̉ đánh giá lượng cơ chṍt còn lại , hay dựng phản ứng (màu) đặc trưng đờ̉ xác định các dextrin có tính khử tạo thành.
Phương pháp định lượng cơ chṍt còn lại , hay sản phõ̉m phản ứng tạo thành có thờ̉ đơn giản là sự đo cơ chṍt còn lại , hay sản phõ̉m phản ứng tạo thành mụ̣t cách trực tiờ́p như cách đo hoạt đụ̣ của lactate dehydrogenase (LDH). Tuy vọ̃y trong nhiờ̀u trường hợp, có thờ̉ phải đo cơ chṍt còn lại hay sản phõ̉m tạo thành mụ̣t cách gián tiờ́p và do đó phộp đo phức tạp hơn . Ví dụ đờ̉ đo hoạt đụ̣ của pyruvate kinase , ngoài cỏch đo phosphoenol pyruvate (PEP) hay ADP còn lại (mà khụng phải lúc nào cũng dờ̃ thực hiợ̀n), người ta có thờ̉ đo pyruvate tạo thành tụng qua sự ghộp nụ́i phản ứng với sự xúc tác của LDH cùng với viợ̀c bụ̉ sung NADH.
- Phương phỏp phúng xạ:dựa trờn sự hình thành các bức xạ của các chṍt đụ̀ng vị phóng xạ gắn vào cơ chṍt tại nhóm chức thích hợp đờ̉ có thờ̉ đo đụ̣ phóng xạ (sự phõn ró) của cơ chṍt còn lại , hay sản phõ̉m tạo thành . Phương pháp phóng xạ thường được áp dụng đờ̉ xác định hoạt đụ̣ của các enzyme mà khi các phương pháp thụng thường (có đụ̣ nhạy thṍp ) khụng thờ̉ đo được . Ví dụ , đờ̉ đo hoạt đụ̣ của enzyme ATPase (xúc tác phản ứng thủy phõn ATP thành ADP và phosphate vụ cơ), người ta có thờ̉ xác định lượng ATP còn lại , hay ADP, hoặc phosphate tạo thành bằng nhiờ̀u phương pháp thụng thường khác nhau . Tuy nhiờn , khi hoạt đụ̣ của ATPase cực kỳ thṍp, người ta có thờ̉ dùng cơ chṍt là γ-[32
P]-ATP, khi đó mụ̣t trong hai thành phõ̀n phản ứng (32
P) có hoạt tính phóng xạ. Bằng cách phụ́i hợp cả hai phương pháp : sắc ký bản mỏng đờ̉ tách riờng γ-[32
P]-ATP và gụ́c phosphate được giải phóng ra từ cơ chṍt ; đo đụ̣ phóng xạ bằng máy nhṍp nháy lỏng đờ̉ tính ra hoạt đụ̣ enzyme.
- Phương phỏp huỳnh quang:Phương pháp này dựa trờn sự phát quang của mụ̣t sụ́ hợp chṍt dưới tác dụng của mụ̣t nguụ̀n sáng kích thích đặc trưng . Mức đụ̣ phát huỳnh quang sẽ đo được nhờ máy huỳnh quang kờ́ . Đõy cũng là phương pháp có đụ̣ nhạy cao, có thờ̉ phát hiợ̀n những enxyme có hoạt đụ̣ thṍp.
Bờn cạnh những phương pháp phõn tích hoạt đụ̣ có tính chṍt định lượng vừa nờu trờn, trong nghiờn cứu enzyme, rṍt nhiờ̀u trường hợp phõn tích định tính hay bán định lượng cũng được sử dụng đờ̉ nhanh chóng phát hiợ̀n hay bước đõ̀u khẳng định có sự hiợ̀n diợ̀n của enzyme. Ví dụ, đờ̉ phát hiợ̀n catalase , người ta chỉ cõ̀n bụ̉ sung mụ̣t lượng cơ ch ṍt là H2O2 và xem bọt khí hình thành (do O2 được giải phóng ). Thường được dùng hơn trong nhọ̃n biờ́t và bán định lượng hoạt đụ̣ enzyme là phương pháp khuờ́ch tán trờn đĩa thạch (iod nhuụ̣m với tinh bụ̣t , xanh coomasie hay amido đen với casein…) đờ̉ xác định hay đánh giá hoạt đụ̣ enzyme qua vòng phõn giải cơ chṍt . Ở
mức cõ̀n khẳng định hơn bản chṍt của các phản ứng có phải do enzyme xỳc tỏc hay khụng, người ta có thờ̉ xử lý nhiợ̀t (đun cách thủy ít phút). Phõ̀n lớn các enzyme có bản chṍt protein đờ̀u bị mṍt hay giảm phõ̀n lớn hoạt tính xúc tác sau khi xử lý ở nhiợ̀t đụ̣ cao. Trong mụ̣t sụ́ trường hợp có thờ̉ dùng các chṍt ức chờ́ đặc hiợ̀u đờ̉ giúp khẳng định sự có mặt của enzyme trong mõ̃u cõ̀n phõn tích (như azide natri ức chờ́ đặc hiợ̀u catalase, phenyl metyl sulphonyl flourid-PMSF ức chờ́ đặc hiợ̀u các protease serine…)