Xỏc định hoạt độ enzyme α-amylase theo phương phỏp Heinkel.

- O CH2 COOH phõn ly

5. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME 1 Nguyờn tắc chung

5.3.2. Xỏc định hoạt độ enzyme α-amylase theo phương phỏp Heinkel.

a. Nguyờn tắc

Amylase xúc tác phản ứng thủy giải tinh bụ̣t thành đường ( đường đơn, đường đụi hay dextrin phõn tử lớn ). Lượng tinh bụ̣t còn lại phản ứng màu với iod.

Xác định lượng tinh bụ̣t bị thủy giải, từ đó tính ra hoạt tính amylase theo định nghĩa:

Hoạt tớnh amylase được biểu thị là số mg tinh bột bị thủy giải bởi 1ml dịch enzyme (hay 1mg nguyờn liệu chứa enzyme) trong 1phỳt ở điều kiện chuẩn 500

C, pH 6. b. Húa chất

Dung dịch NaH2PO4 0,05M: hũa tan 1,9502g NaH2PO4.2H2O trong nước thành 250 ml.

Dung dịch Na2HPO4 0,05M: hũa tan 0,8962g Na2HPO4.12H2O trong nước thành 50 ml.

Dung dịch đợ̀m phosphate 0,05 M pH 6: trụ̣n 87,7ml dung dịch NaH2PO4 0,05M và 12,3ml dung dịch Na2HPO4 0,05M thờm 100ml nước cṍt, đo lại pH bằng máy pH

Dung dịch tinh bụ̣t 1% pha trong pH 6: lṍy 50ml dung dịch đợ̀m phosphat 0,05M pH 6 đem đun sụi. Cõn 1 g tinh bụ̣t tan, hòa vào mụ̣t ít đợ̀m, khuṍy đờ̀u, đụ̉ vào dung dịch đợ̀m đang sụi, vừa khuṍy vừa đun sụi trong 3 phút cho đờ́n khi dung dịch trong suụ́t. Định mức tới 100ml bằng dung dịch đợ̀m.

Dung dịch Iod: 1g I2 và 2g KI, thờm nước thành 100ml, bảo quản lạnh. Khi dùng pha loãng 500 lõ̀n.

Dung dịch HCl 1N: 8,4ml HCl đọ̃m đặc pha thành 100ml Dung dịch HCl 0,1N: pha loãng từ dung dịch HCl 1N NaCl 0,1%

c. Tiến hành thớ nghiệm

Bảng 3.6. Dựng đường chuẩn tinh bột

ễ́ng nghiợ̀m 1 2 3 4 5 6

Tinh bụ̣t 10mg/ml (ml) 0 1 2 3 4 5

Dung dịch đợ̀m (ml) 5 4 3 2 1 0

Nụ̀ng đụ̣ tinh bụ̣t (mg/ml) 0 2 4 6 8 10

Hút 0,1ml dung dịch từ các ụ́ng nghiợ̀m thờm 0,9 ml đợ̀m, thờm vào 9 ml dung dịch I2KI đã pha loãng 500 lõ̀n.

Đem so màu ở bước sóng 560nm.

Bảng 3.7. Phản ứng enzyme

Thử thật ( 3 ống ) Thử khụng ( 3 ống )

Tinh bụ̣t 1% (ml) 1 1

NaCl 0,1% (ml) 1 1

Đợ̀m Phosphate pH 6 (ml) 2 2

Lắc đờ̀u, đờ̉ ụ̉n nhiợ̀t ở 50o

C trong 5 phỳt

Dung dịch enzyme (ml) 1 0

Đờ̉ ụ̉n nhiợ̀t ở 50o

C, 10 phỳt

Dung dịch HCl 0.1N (ml) 5 5

Dung dịch enzyme (ml) 0 1

- Hút 1ml dung dịch từ các ụ́ng nghiợ̀m trờn. Thờm vào mụ̃i ụ́ng nghiợ̀m 9ml dung dịch I2KI đã pha loãng 500 lõ̀n.

- Lắc đờ̀u, đem đo OD tại bước sóng 560nm.

d) Cụng thức tớnh toỏn:Hoạt đụ̣ α-Amylase trong 1ml dịch enzyme