- O CH2 COOH phõn ly
4. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN
4.2. Xác định hàm lượng protein bàng phương pháp quang phổ
Nguyờn tắc của phương pháp này là các acid amin có chứa vòng thơm như trytophane, tyrosine và phenylalanine trong chuụ̃i pholypeptid có phụ̉ hṍp thụ cực đại ở bước sóng 280nm.
Sử dụng BSA làm chṍt chuõ̉n, biờ́t rằng ở bước sóng 280nm 1ml BSA có nụ̀ng đụ̣ 1mg/ml sẽ có mọ̃t đụ̣ quang học là OD = 0,67. Dựa vào đó có thờ̉ xác định hàm lượng protein trong các mõ̃u thí nghiợ̀m theo cụng thức sau:
Y(mg) = 67 , 0 . ]. [OD aV Trong đó:
+ [OD]: mọ̃t đụ̣ quang học của 1ml dung dịch mõ̀u. + V: thờ̉ tích dung dịch mõ̀u.
+ a: đụ̣ pha loãng dung dịch.
Khi thực hiện phương pháp này cần chỳ ý các điểm sau:
1- Con sụ́ 0,67 là hợ̀ sụ́ tắt của BSA. Đờ̉ xác định nụ̀ng đụ̣ các loại protein khác thì cõ̀n phải sử dụng hợ̀ sụ́ tắt tương ứng đụ́i với mụ̃i loại protein. Ví dụ: hợ̀ sụ́ tắt của protein con A là 1, 2.
2- Lựa chọn các protein tiờu chuõ̉n cõ̀n có cṍu trúc tương tự như cṍu trúc của các protein cõ̀n đo xột nghiợ̀m ở mõ̃u nghiờn cứu vì các protein thường có hợ̀ sụ́ tắt khác nhau ở bước sóng 280nm (Hợ̀ sụ́ tắt biờ̉u thị bằng sự hṍp thụ của dung dịch 1% protein đụ́i với mụ̣t tia sáng có bờ̀ dày 1cm). Thờm vào đó, các protein có cṍu trúc khác nhau cũng cho khả năng tạo phản ứng mõ̀u khác nhau với các thuụ́c thử tạo mõ̀u như thuụ́c thử folin – ciocalteu, coomassie brilliant blue G 250.
Sau đõy là bảng cho các giá trị hợ̀ sụ́ tắt (E 1280% , nghĩa là sự hṍp thụ của dung dịch 10mg protein/ml ở bước sóng 280nm) đụ́i với mụ̣t sụ́ loại protein khác nhau:
Bảng 3.1. Hệ số tắt của một số protein ở bước súng 280nm (theo Fashman, 1976) Cỏc protein E1280% IgG 13,6 IgM 11,8 IgA 13,2 IgA tiờ́t 13,1 IgD 17,0 IgE 15,3 Chuụ̃i γ 13,7 Chuụ̃i à 13,9 Chuụ̃i α 15,5 Chuụ̃i nhẹ 12,3 Fab 15,0 Fc 12,0 VH 27,0
Con A (lectin Canavalia
ensiformis) 12,0
Lectin Lens culinaris (LCA) 12,5
BSA 6,7
3- Nờ́u chưa biờ́t hợ̀ sụ́ tắt của protein, hoặc dung dịch gụ̀m hụ̃n hợp của mụ̣t sụ́ dạng protein thì nụ̀ng đụ̣ protein tụ̉ng sụ́ có thờ̉ được tính theo phương trình sau:
Nụ̀ng đụ̣ protein, tính theo mg/ml = 1,55 x A280 – 0,77 x A260 Trong đó:
+ A280 là giá trị hṍp thụ ở bước sóng 280 nm. + A260 là giá trị hṍp thụ ở bước sóng 260 nm.
4- Nờ́u tỉ lợ̀ A280/A260 thṍp hơn 0,6 nghĩa là dung dịch protein đã lõ̃n (nhiờ̃m) acid nucleic, các peptid, chṍt tõ̉y rửa hoặc chṍt kháng khuõ̉n azit natri (NaN3). Trường hợp này cõ̀n sử dụng phộp đo nụ̀ng đụ̣ protein theo kỹ thuọ̃t Lowry hoặc Bradford.
5- Dung dịch protein có nụ̀ng đụ̣ thṍp hơn 0,1mg/ml thường cho kờ́t quả khụng chớnh xỏc.