Nuụi cấy đờ̉ thu nhận protease

- O CH2 COOH phõn ly

3- Nuụi cấy đờ̉ thu nhận protease

Đờ̉ thu nhọ̃n protease từ nguụ̀n vi sinh vọ̃t cũng thực hiợ̀n quan các cụng đoạn tương tự như các enzyme khác. Bước đõ̀u chọn giụ́ng vi sinh vọ̃t có khả năng tụ̉ng hợp enzyme cao. Sau khi có giụ́ng, bước tiờ́p theo là chọn phương pháp nuụi: nuụi trờn mụi trường rắn hay trong mụi trường lỏng. Khi đã quyờ́t định phương pháp nuụi, có nghĩa là đã sẵn sàng vờ̀ điờ̀u kiợ̀n thiờ́t bị, mặt bằng thì phải chọn mụi trường nuụi và điờ̀u kiợ̀n nuụi: pH, nhiợ̀t đụ̣, chờ́ đụ̣ thụng đụ̣ thụng khí, thời gian nuụi, vv ... và cuụ́i cùng là tách chiờ́t và tinh chờ́ enzyme đờ̉ tạo sản phõ̉m.

Đờ̉ thu nhọ̃n protease có thờ̉ sử dụng phương pháp nuụi trờn mụi trường rắn hoặc trong mụi trường lỏng. Nhiờ̀u nghiờn cứu cho rằng, sử dụng phương pháp bờ̀ mặt kinh tờ́ hơn phương pháp chìm. Hiợ̀n nay phương pháp bờ̀ mặt được sử dụng rụ̣ng rãi ở Nhọ̃t. Điờ̀u kiợ̀n nuụi như nhiợ̀t đụ̣, pH, chờ́ đụ̣ khí phụ thuụ̣c vào chủng loại vi sinh vọ̃t. Đụ́i với nṍm sợi, nhiợ̀t đụ̣ nuụi 20ữ31oC, đụ̣ õ̉m mụi trường 50ữ55%. Đụ́i với vi khuõ̉n nhiợ̀t đụ̣ nuụi thích hợp là 37ữ38o

C.

1.3.3. Thu nhận enzyme pectinase

Pectinase là enzyme phõn giải pectin, là mụ̣t loại polysaccharid của thực vọ̃t được cṍu tạo từ các dõ̃n xuṍt của đường galactose là galacturonic, trong đó mụ̣t sụ́ gụ́c galacturonic bị mytyl hóa (nhóm -COOH thay bằng -COOCH3). Ở thực vọ̃t pectin tụ̀n tại dưới 2 dạng: protopectin khụng hòa tan và pectin hòa tan. Protopectin nằm liờn kờ́t với thành tờ́ bào. Ở quả khi còn xanh thì pectin nằm dưới dạng protopectin nờn tạo đụ̣ chắc cho quả, khi quả chín nhờ enzyme chuyờ̉n protopectin thành pectin hòa tan làm quả mờ̀m. Enzyme pectinase đóng vai trò quan trọng trong sản xuṍt nước quả ộp.

1-Phõn loại enzyme pectinase

Dựa vào cơ chờ́ tác dụng người ta phõn enzyme enzyme pectinase thành các loại sau:

- Pectinesterase: enzyme xúc tác phản ứng thủy phõn các nhóm metyl ester, enzyme thường tṍn cụng vào nhóm metyl ester (-COOCH3) nằm kờ̀ nhóm carboxyl enzyme thường tṍn cụng vào nhóm metyl ester (-COOCH3) nằm kờ̀ nhóm carboxyl (-COOH) khụng ester hóa trong mạch phõn tử pectin. Sản phõ̉m tạo thành là rượu metylic (CH3OH) và axit pectic (mạch phõn tử pectin khụng mytyl hóa). Enzyme này tìm thṍy ở thực vọ̃t và vi sinh vọ̃t. Ở vi sinh vọ̃t là enzyme ngoại bào, còn ở thực vọ̃t thì chúng nằm ở xoang ngoài màng sinh chṍt nhưng trong màng tờ́ bào (enzyme periplasmic). Ở quả enzyme này thường tăng trong giai đoạn quả bắt đõ̀u chín. Pectinesterase của thực vọ̃t tṍn cụng vào hoặc đõ̀u khụng khử hoặc gắn với nhóm

carboxyl tự do và tiờ́p tục phõn cắt dọc phõn tử tạo ra khụ́i axit galacturonic khụng bị ester húa.

- Polygalacturonase (còn có tờn gọi là α-(1-4) galacturoniglucano-hydrolase: xúc tác phõn cắt mụ́i liờn kờ́t α-(1-4) glycozit trong phõn tử pectin. Polygalacturonase xúc tác phõn cắt mụ́i liờn kờ́t α-(1-4) glycozit trong phõn tử pectin. Polygalacturonase là mụ̣t phức hợ̀ enzyme, có loại phõn cắt ngõ̃u nhiờn các liờn kờ́t α-(1-4) glycozit, cú loại phõn cắt liờn kờ́t α-(1-4) glycozit bắt đõ̀u từ đõ̀u khụng khử. Enzyme này có ở thực vọ̃t và ci sinh vọ̃t. Enzyme làm giảm đụ̣ nhớt của dung dịch axit pectic.

- Pectatelyase: xúc tác phõn cắt các đơn vị galacturonic khụng bị ester hóa. Cơ chṍt thích hợp là axit pectic (mạch pectin khụng bị metyl hóa, chỉ có nhóm -COOH và chṍt thích hợp là axit pectic (mạch pectin khụng bị metyl hóa, chỉ có nhóm -COOH và khụng cú nhúm -COOCH3) hay pectin có chỉ sụ́ metyl hóa thṍp. Pectatelyase có hai loại: endo-pectatelyase và exo-pectatelyase, cả hai loại đờ̀u cõ̀n ion Ca+2 đờ̉ hoạt đụ̣ng. Pectatelyase khụng tìm thṍy ở cõy xanh, nhưng có ở vi khuõ̉n và nṍm, là enzyme ngoại bào. Vi sinh vọ̃t gõy bợ̀nh cho thực vọ̃t tiờ́t enzyme này đờ̉ phá hủy thành tờ́ bào thực vọ̃t làm mờ̀m và làm mục mụ thực vọ̃t.

Ngoài ra cũn cú: α-(1-4) galacturonite-methylesterglucanoliase, α-(1-4) galacturonite-glucanoliase, là những enzyme tác dụng lờn pectin và axit pectic.

2- Vi sinh vật cú khả năng tổng hợp pectinase cao

Enzyme pectinase tìm thṍy ở nṍm mụ́c, nṍm men và vi khuõ̉n, trong đó nṍm mụ́c có hợ̀ enzyme phong phỳ. Bảng 4.4 giới thiợ̀u mụ̣t sụ́ vi sinh vọ̃t tụ̉ng hợp pectinase. Các loại vi sinh vọ̃t sinh pectinase phõn bụ́ trờn bờ̀ mặt của quả, thõn lá. Khi quả bị hư hỏng hay cõy chờ́ chúng sẽ phá hủy nhanh chóng.

Bảng 4.4. Một số vi sinh vật tổng hợp pectinase

TT Loại vi sinh vật Tờn vi sinh vật

1 Nṍm mụ́c Penicillium glaucum Penicillium ehrlichii Penicillium chrysogenum Penicillium expannam Penicillium cilrimim Aspergillus awamori Aspergillus foeticus Aspergillus niger Aspergillus terrus

2 Nṍm men Saccharomyces fragilis

3 Vi khuõ̉n Bacillus polymyxa Flavobacterium pectinovorum Klebsiella aerogenes Lactobacillus plantarun Clostridium pectinofermentants Clostridium felsineum

3-Nuụi vi sinh vật đờ̉ thu nhận enzyme pectinase

Pectinase hiợ̀n nay được thu nhọ̃n chủ yờ́u từ nguụ̀n vi sinh vọ̃t. Đụ́i với các loại nṍm sợi người ta sử dụng cả hai kiờ̉u nuụi: Nuụi cṍy bờ̀ mặt và nuụi cṍy chìm. Nuụi theo phương pháp bờ̀ mặt, mụi trường có thờ̉ sử dụng là cám gạo, cám mì, bã củ cải và thóc mõ̀m. Nguụ̀n nitơ vụ cơ bụ̉ sung là các muụ́i amon. Đụ́i với Aspergillus awamori

nhiợ̀t đụ̣ nuụi là 30oC, thời gian nuụi là 40 giờ, sau đó giảm nhiợ̀t đụ̣ xuụ́ng 24o

C và nuụi đờ́n 52 giờ. Sản phõ̉m sau lờn men được sṍy khụ và đóng gói thành chờ́ phõ̉m enzyme thụ.

Khi nuụi bằng phương pháp chìm, đụ́i với nṍm mụ́c phải sục khí đờ̉ cung cṍp oxy hòa tan cho nṍm. Trong mụi trường lỏng, sự tích tụ enzyme bắt đõ̀u khi sự phát triờ̉n của vi sinh vọ̃t gõ̀n đờ́n pha ụ̉n định.

Mụ̣t sụ́ chủng được nuụi yờ́m khí đờ̉ thu enzyme như Clostridium pectino- fermentants hay Clostridium felsineum. Clostridium pectinofermentants tích lũy enzyme mạnh ở pha tăng trưởng, tăng đụ̀ng thời với sự tích lũy sinh khụ́i và đạt mức tụ́i đa ở pha cõn bằng.

Đờ̉ thu chờ́ phõ̉m enzyme khi nuụi trong mụi trường lỏng, người ta tách tờ́ bào vi sinh vọ̃t ra và thu dịch mụi trường. Vì đõy là enzyme ngoại bào nờn chúng được tích lũy ở mụi trường. Dịch mụi trường được cụ đặc chõn khụng ở nhiợ̀t đụ̣ thṍp đờ́n khi nụ̀ng đụ̣ chṍt khụ đạt 5ữ8 %, sau đó sṍy phun thu chờ́ phõ̉m enzyme thụ.

Có thờ̉ thu chờ́ phõ̉m enzyme từ dịch mụi trường sau khi tách tờ́ bào vi sinh vọ̃t bằng cách kờ́t tủa với muụ́i (NH4)2SO4 , hoặc với dung mụi hữu cơ. Cõ̀n lưu ý rằng nờ́u đờ̉ lõu trong dung mụi hữu cơ thì hoạt đụ̣ enzyme sẽ giảm.

1.3.4. Thu nhận enzyme cellulase

Cellulase là mụ̣t hợ̀ enzyme, xúc tác sự thuỷ phõn cellulose thành cellobiose và cuụ́i cùng thành glucose. Cellulase được sinh ra từ quá trình trao đụ̉i chṍt của các vi sinh vọ̃t như vi khuõ̉n, nṍm men, xạ khuõ̉n. Ngoài ra, người ta còn tìm thṍy cellulase ở thực vọ̃t và đụ̣ng vọ̃t.

Cellulase là mụ̣t trong những enzyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyờ̉n hóa vọ̃t chṍt hữu cơ trong tự nhiờn và có ý nghĩa rṍt lớn trong sản xuṍt thực phõ̉m và trong xử lý mụi trường. Các nghiờn cứu ứng dụng enzyme này diờ̃n ra chọ̃m hơn so với amylase và protease.

1-Phõn loại enzyme cellulase

Hợ̀ enzyme cellulase gụ̀m có 3 enzyme chính:

- Endo-β-glucanase (EC 3.2.1.4), có khả năng phõn cắt liờn kờ́t β(1-4) glycosit ở bṍt cứ chụ̃ nào bờn trong mạch phõn tử cellulose, sản phõ̉m phõn giải là cellodextrin, cellobiose và glucose.

- Exo-β-glucanase (β-glucan cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91), xúc tác phõn cắt mụ̣t cách liờn tiờ́p các đơn vị cellobiose từ đõ̀u khụng khử của mạch phõn tử cellulose.

- β-glucosidase (EC 3.2.1.21), hay còn gọi là cellobiase thuỷ phõn cellobiose thành glucose. Enzyme này khụng có khả năng phõn giải cellulose nguyờn thủy.

Ba loại phản ứng của các enzyme trờn được minh họa bằng hình 4.4.

Cơ chờ́ tác dụng của cellulase có nhiờ̀u trường phái khác nhau. Theo Mandel và Reese (1964) thì sự phõn giải cellulose dưới tác dụng của hợ̀ enzyme cellulase xảy ra theo 3 giai đoạn chủ yờ́u sau:

+ Trong giai đoạn thứ nhṍt, dưới tác dụng của tác nhõn C1 , cellulose nguyờn thờ̉ thành cellulose hoà tan.

Hỡnh 4.4. Cơ chế phản ứng thuỷ phõn của hệ enzyme cellulase

+ Trong giai đoạn thứ hai, cellulose bị thuỷ phõn dưới tác dụng của hợ̀ enzyme thuỷ phõn Cx (gụ̀m endo-β-glucanase và exo-β-glucanase) tạo thành đường cellobiose.

+ Ở giai đoạn cuụ́i cùng, dưới tác dụng của enzyme cellobiase, β- glucosidase, đường cellobiose bị thủy phõn thành glucose.

Cellulose → cellulose phản ứng → cellobiose → glucose

↑ ↑ ↑

C1 Cx β-glucosidase

C1 có tính khụng đặc hiợ̀u. Dưới tác dụng của C1, cellulose bị hṍp thụ nước, trương lờn và chuõ̉n bị cho sự tác đụ̣ng của các enzyme khác. Nờ́u tách riờng C1 cho hoạt đụ̣ng đụ̣c lọ̃p thì tác dụng này lại khụng thṍy rừ ràng. Vì vọ̃y, người ta cho rằng đó chỉ là 1 yờ́u tụ́ (factor), khụng phải là enzyme.

2-Vi sinh vật cú khả năng tổng hợp cellulase cao

Có thờ̉ nói vi sinh vọ̃t là tác nhõn phõn giải cellulose quan trọng nhṍt của tự nhiờn. Người đõ̀u tiờn nghiờn cứu khả năng phõn giải cellulose của các vi sinh vọ̃t kị khí là Popov vào năm 1875, tiờ́p đó là Omelianxki. Còn người đõ̀u tiờn phát hiợ̀n khả năng phõn giải celulose bởi vi khuõ̉n hiờ́u khí là G.Van Itrerson vào năm 1903.

Trước đó, hoạt đụ̣ng phõn giải cellulose bởi vi sinh vọ̃t sụ́ng trong dạ dày cỏ của các đụ̣ng vọ̃t nhai lại đã được chứng minh (1955).

Đờ́n 1971, người đã phõn lọ̃p được mụ̣t sụ́ loại vi sinh vọ̃t có khả năng phõn giải cellulose trong dạ dày cỏ của đụ̣ng vọ̃t nhai lại, trong đó có 2 loại được nghiờn cứu kỹ hơn là Ruminococus và R. flavefacicus.

Hiợ̀n nay, rṍt nhiờ̀u vi sinh vọ̃t phõn giải cellulose được tìm thṍy trong đṍt, nước và phõn bón hữu cơ. Đáng chú ý hơn cả là vi khuõ̉n thuụ̣c nhóm celludomonas. Nṍm và xạ khuõ̉n cũng là những vi sinh vọ̃t có khả năng phõn giải cellulose cao.

Mụ̣t sụ́ nṍm có khả năng tụ̉ng hợp cellulase cao như: Trichoderma viride, Sporotrichum P.ruinosum, pennicilium pusillum, Aspergillus fumigatus, Asp. terres, …

Khả năng phõn giải cellulose của xạ khuõ̉n đã được nghiờn cứu nhiờ̀u. Harmsen (1964) đã chia xạ khuõ̉n phõn huỷ cellulose ra làm ba nhóm A, B và C. Nhóm B và C phõn huỷ cellulose rṍt mạnh mẽ.

Theo khoá phõn loại của Waksman (1961) thì nhóm A thuụ̣c loại nhóm albo- fravus và nhúm fradii-asteroides, và nhóm C gụ̀m các loài thuụ̣c nhóm albo-lateus, nhóm B thuụ̣c các loài Act. diastaticus, Act. lipmanii. Theo Krasilnikov (1949) thỡ cỏc loài xạ khuõ̉n phõn giải cellulose có thờ̉ xờ́p hạng theo mức đụ̣ phõn giải từ mạnh xuụ́ng yờ́u như sau:

+ Loài 1: Act. coelicolor, Act. sulfureus, Act. aureus, Act. cellulosae, Act. verne, Act. glaucus, Act. candidus, Act. diaslaticus, Act. chroleucus, Act. chromogenes.

+ Loài 2: Act. hydroscopicus, Act. griseoflavus, Act. ochroleucus, Act. loidensis, Act. viridans, Act. griseolus.

+ Loài 3: Act. themofuscus, Act. xanthostromus.

+ Loài 4: Act. flavochromogenes, Act. bovis, Act. sampsonii.

Các vi sinh vọ̃t có khả năng tụ̉ng hợp cellulase rṍt nhiờ̀u, tuy nhiờn, người ta chưa tìm thṍy mụ̣t loài nào có khả năng cùng mụ̣t lúc tụ̉ng hợp các loại cellulase đờ̉ có thờ̉ phõn giải hoàn toàn cellulose, mà có loài tụ̉ng hợp enzyme này mạnh, loài khác tụ̉ng hợp enzyme kia mạnh.

Các loài vi sinh vọ̃t trong tự nhiờn thay phiờn nhau phõn hủy cellulose đờ́n sản phõ̉m cuụ́i cùng là glucose.

3- Nuụi vi sinh vật đờ̉ thu nhận enzyme cellulase

Hiợ̀n nay, enzyme cellulase được sản xuṍt chủ yờ́u từ nṍm sợi và xạ khuõ̉n. Phương thức nuụi cṍy chủ yờ́u là trờn mụi trường rắn (phương pháp nuụi bờ̀ mặt). Cả xạ khuõ̉n và nṍm sợi đờ̀u phát triờ̉n tụ́t trờn mụi trường xụ́p, có đụ̣ õ̉m 60ữ65% và có cơ chṍt cảm ứng là cellulose.

Thành phõ̀n mụi trường có thờ̉ rṍt đa dạng và phụ thuụ̣c vào loại vi sinh vọ̃t, tuy nhiờn, phải đảm bảo các yờ́u tụ́ chính như thành phõ̀n dinh dưỡng (thành phõ̀n carbon, nitơ, khoáng, vv ...), có đụ̣ xụ́p nhṍt định, đảm bảo đụ̣ thoáng đờ̉ có thờ̉ cung cṍp đủ oxy cho chúng và phải có thành phõ̀n cellulose.

Điờ̉m cõ̀n lưu ý là xạ khuõ̉n phát triờ̉n tụ́t trong mụi trường kiờ̀m và mụi trường axit yờ́u, còn nṍm sợi phát triờ̉n tụ́t trong mụi trường axit.

Vì vọ̃y, khi chuõ̉n bị mụi trường thì cõ̀n lưu ý đờ́n pH. Giá trị pH ban đõ̀u của mụi trường nuụi xạ khuõ̉n là 6,2ữ7,6 - còn pH của mụi trường nuụi nṍm sợi là 4,5ữ5,5 ...

Thời gian phát triờ̉n và sinh tụ̉ng hợp enzyme cellulase của xạ khuõ̉n và nṍm sợi cũng khác nhau. Thời gian phát triờ̉n và sinh tụ̉ng hợp cellulase của nṍm sợi khoảng từ 36 đờ́n 48 giờ, trong khi đó, thời gian này đụ́i với xạ khuõ̉n phải kộo dài đờ́n 72 giờ.

Khả năng chịu nhiợ̀t của xạ khuõ̉n tụ́t hơn nṍm sợi, vì vọ̃y, enzyme cellulase của xạ khuõ̉n cũng có khả năng chịu nhiợ̀t cao hơn nṍm sợi.