ĐỊNH TÍNH PROTEIN DỰA TRấN PHƯƠNG PHÁP LAI THẨM TÍCH (WESTERN BLOT)

- O CH2 COOH phõn ly

2. ĐỊNH TÍNH PROTEIN DỰA TRấN PHƯƠNG PHÁP LAI THẨM TÍCH (WESTERN BLOT)

(WESTERN BLOT)

Mặc dù có bản chṍt khác ADN và ARN, viợ̀c xác định sự có mặt của mụ̣t loại protein trong sụ́ các protein có trong mõ̃u sinh học theo nguyờn tắc gõ̀n giụ́ng với các phương pháp thõ̉m tách (còn gọi là lai) Southern và Northern (tương ứng với trường hợp của ADN và ARN). Tuy vọ̃y, đụ́i với protein, phương định tính này dựa trờn dựa trờn nguyờn tắc miờ̃n dịch đặc thù của protein nờn còn được gọi là phương pháp thõ̉m tách miờ̃n dịch (immunoblotting) hay phương pháp thõ̉m tách (lai) Western. Trong phương pháp lai thõ̉m tách miờ̃n dịch, các phõn tử protein sau khi được phõn tách trờn điợ̀n di được chuyờ̉n và gắn lờn màng. Màng này sau đó được ủ trong mụ̣t dung dịch chứa kháng thờ̉ đặc hiợ̀u với loại protein tinh sạch được quan tõm nghiờn cứu. Kháng thờ̉ sẽ tìm thṍy loại protein tương ứng ở trờn màng lọc và gắn vào. Cuụ́i cùng, bằng viợ̀c sử dụng phản ứng enzyme hiợ̀n màu, người ta có thờ̉ quan sát được vị trí kháng thờ̉ liờn kờ́t trờn màng. Như vọ̃y, tṍt cả các phương pháp lai Southern, Northern và Western đờ̀u có điờ̉m chung là sử dụng các hợp chṍt chọn lọc đờ̉ quan sát sự có mặt của mụ̣t hoặc mụ̣t sụ́ loại phõn tử đặc thù trong các hụ̃n hợp phức tạp.

 Phương pháp lai thẩm tớch (Western blot) bao gụ̀m các bước cơ bản sau:

- Các protein được chuyờ̉n sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyờn vị trí như đã phõn tỏch trờn gel.

- Ủ màng lai đã cụ́ định protein với mụ̣t kháng thờ̉ sơ cṍp (primary antibody). Kháng thờ̉ sơ cṍp là mụ̣t kháng thờ̉ đặc hiợ̀u, sẽ bám vào protein và tạo thành mụ̣t phức hợp protein-kháng thờ̉ đụ́i với protein quan tõm.

- Tiờ́p theo ủ màng lai với mụ̣t kháng thờ̉ thứ cṍp (secondary antibody) cú enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) đi kốm. Kháng thờ̉ thứ cṍp sẽ bám vào kháng thờ̉ sơ cṍp giụ́ng như kháng thờ̉ sơ cṍp đã bám vào protein.

- Tiờ́p tục ủ màng lai trong mụ̣t hụ̃n hợp phản ứng đặc hiợ̀u với enzyme. Nờ́u mọi viợ̀c đờ̀u diờ̃n ra mụ̣t cách chính xác sẽ phát hiợ̀n thṍy các băng ở bṍt kỳ nơi nào có mặt phức hợp protein-kháng thờ̉ sơ cṍp-kháng thờ̉ thứ cṍp-enzyme hay nói cách khác là ở bṍt kỳ nơi nào có mặt protein quan tõm.

- éặt mụ̣t phim nhạy cảm với tia X lờn màng lai đờ̉ phát hiợ̀n các điờ̉m sáng phát ra do enzyme.

Hỡnh 3.3. Cỏc bước thực hiện phương phỏp lai thẩm tớch