3.1. Các phương pháp kết tủa
Kờ́t tủa là phương pháp được sử dụng rṍt rụ̣ng rãi trong các nghiờn cứu enzyme trong phòng thí nghiợ̀m và sản xuṍt enzyme ở quy mụ cụng nghiợ̀p . Phương pháp kờ́t tủa dựa trờn nguyờn tắc , enzyme là mụ̣t phức hợp protein có khả năng tạo kờ́t tủa mụ̣t sụ́ chṍt. Trong quá trình kờ́t tủa người ta phõn biợ̀t hai thuọ̃t ngữ : kờ́t tủa õm và kờ́t tủa dương.
Kết tủa õm là sự kờ́t tủa protein tạp, phõ̀n protein cõ̀n thiờ́t nằm trong dung dịch chứ khụng nằm trong phõ̀n tủa.
Kết tủa dương thỡ hoàn toàn ngược lại, các protein lại nằm trong phõ̀n kờ́t tủa. Chính sự phức tạp này, phương pháp kờ́t tủa khó thu nhọ̃n enzyme hoàn toàn tinh khiờ́t. Muụ́n thu được protein tinh khiờ́t hơn , người ta phải sử dụng những phương pháp đặc biợ̀t khác.
Ở phõn tử enzyme, các gụ́c ưa nước và kỵ nước thường nằm trờn bờ̀ mặt . Chỳng quyờ́t định mức đụ̣ hòa tan của enzyme. Trong đó các nhóm kỵ nước thường có khuynh hướng nằm trong lòng phõn tử enzyme, mụ̣t phõ̀n khụng nhỏ nhóm này lại nằm trờn bờ̀ mặt enzyme và có khả năng tiờ́p xúc với dung mụi , các nhóm này sẽ cùng với các nhóm tích điợ̀n và các nhóm lưỡng cực khác có vai trò quyờ́t định đờ́n tính chṍt enzyme.
Đụ̣ hòa tan của enzyme được coi là kờ́t quả của tương tác lưỡng cực của chṍt hòa tan với nước và tương tác ion của chúng với muụ́i có trong dung dịch . Nờ́u bờ̀ mặt enzyme có tính kỵ nước cao , có nghĩa là chỉ mụ̣t phõ̀n nhỏ của chúng tương tác được với dung mụi, còn mụ̣t sụ́ ít hơn nữa các nhóm tích điợ̀n thì tương tác với muụ́i . Nờ́u điợ̀n tích giảm tới 0, sự đõ̉y tích điợ̀n sẽ giảm theo mức đụ̣ tiờ́n gõ̀n đờ́n điờ̉m đẳng điợ̀n và các phõn tử sẽ hút lõ̃n nhau mạnh hơn , dõ̃n tới sự tạo tủa. Hiợ̀n tượng này gọi là kờ́t tủa ở điờ̉m đẳng điợ̀n.
3.1.1. Kết tủa đẳng điện
Protein là chṍt lưỡng cưc (ampholyte), chúng có cả nhóm acid và nhóm base . Mức đụ̣ hòa tan của enzme phụ thuụ̣c vào pH , mức đụ̣ này là là tụ́i thiờ̉u khi chúng ở điờ̉m đẳng điợ̀n , phõ̀n lớn protein có điờ̉m đẳng điợ̀n ở khoảng acid , vì thờ́ quá trình này được gọi là kờ́t tủa acid (acid precipitation).
Kờ́t tủa enzyme ở điờ̉m đẳng điợ̀n thường được thực hiợ̀n ở quy mụ nhỏ , chứ khụng thực hiợ̀n ở quy mụ cụng nghiợ̀p . Thời gian tạo điờ̉m đẳng điợ̀n và thời gian lưu đờ̉ tạo kờ́t tủa bờ̀n vững thường làm thay đụ̉i hoạt tính enzyme. Như vọ̃y, thiờ́t bị phản ứng càng lớn , khả năng làm thay đụ̉i hoạ t tớnh enzyme càng lớn. Khi đó, thời gian khuṍy trụ̣n và thời gian lắng kờ́t tủa càng kộo dài, enzyme càng dờ̃ bị biờ́n tính.
3.1.2. Kết tủa phõn đoạn bằng muối trung tớnh (phương phỏp diờm tớch)
Phương pháp kờ́t tủa phõn đoạn bằng (NH4)2SO4 dựa trờn cơ sở sự khác nhau vờ̀ khả năng kờ́t tủa của các protein các nụ̀ng đụ̣ muụ́i khác nhau (tính theo phõ̀n % nụ̀ng đụ̣ bão hòa), được dùng phụ̉ biờ́n đờ̉ loại bỏ bước đõ̀u protein tạp của các dịch enzyme. Các loại muụ́i có thờ̉ được dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4 ... người ta đã nhọ̃n
thṍy muụ́i (NH4)2SO4 là tụ́t nhṍt vì nó khụng làm hại mà làm ụ̉n định (làm bờ̀n) hõ̀u hờ́t các loại protein, loại muụ́i này lại rẻ và phụ̉ biờ́n. Đụ̣ hòa tan của nó lại rṍt lớn (bão hòa 767g/l ở 250C). Ngoài ra nụ̀ng đụ̣ (NH4)2SO4 cõ̀n thiờ́t đờ̉ kờ́t tủa protein khác nhau thì khác nhau nhiờ̀u. Ví dụ: Protease của nṍm mụ́c dờ̃ bị kờ́t tủa ở 70% của (NH4)2SO4 bão hòa hoàn toàn, còn amylase của mõ̀m lúa bị kờ́t tủa ở 50% đụ̣ bão hòa của dung dịch muụ́i này. Điờ̀u đó nói lờn tính kờ́t tủa lựa chọn của (NH4)2SO4 cao hơn các muụ́i khác.
Người ta thường dùng hai dạng (NH4)2SO4: dạngbụ̣t hoặc bão hòa
- Khi dựng bột:Người ta cho từng ít mụ̣t vào dịch chiờ́t protein. Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đờ́n lượng kờ́t tủa ban đõ̀u của protein. Khi cho muụ́i vào dịch chiờ́t cõ̀n phải có máy khuṍy từ đờ̉ đảm bảo sự hòa tan của muụ́i.
- Khi dựng dung dịch bóo hòa: Trong nhiờ̀u sách vờ̀ phương pháp nghiờn cứu, người ta đưa ra bảng tính sụ́ lượng muụ́i cõ̀n thiờ́t đờ̉ pha các dung dịch có đụ̣ bão hòa khác nhau ở những nhiợ̀t đụ̣ nhṍt định. Khái niợ̀m vờ̀ sụ́ phõ̀n trăm của đụ̣ bão hòa hoàn toàn đã được đờ̀ cọ̃p đờ́n. Như ví dụ trờn đã nói, protein có thờ̉ bị kờ́t tủa ở 50% (0,5) hoặc 70% (0,7) của đụ̣ bão hòa hoàn toàn của (NH4)2SO4. Khi cho dung dịch (NH4)2SO4 vào dịch chiờ́t protein thì nụ̀ng đụ̣ (NH4)2SO4 khụng tăng đụ̣t ngụ̣t.
Sau khi kờ́t tủa xong người ta thường đờ̉ lắng khoảng 2h hoặc đờ̉ qua đờm, mục đích là tạo kờ́t tủa hoàn toàn (ở phương pháp dùng dung mụi hữu cơ thì khụng cõ̀n đờ̉ lõu). Kờ́t tủa được lṍy ra bằng cách ly tõm hoặc lọc qua phờ̃u Buckner. Khi hòa tan kờ́t tủa lại người ta thường thờm ion Ca2+làm bờ̀n (CaCl2hoặc Ca(COOH)2).
Ở giai đoạn loại muụ́i, người ta dùng phương pháp thõ̉m tích. Thời gian thõ̉m tích thường là 24 ữ 28h, nước thay càng nhiờ̀u càng nhanh càng tụ́t.
Có thờ̉ loại muụ́i bằng cách lọc qua gel sephadex G25 (dẫn suất của dextran). Ưu thờ́ của phương pháp này là tiờ́n hành với thời gian ngắn (khoảng 30 phỳt), nờn khụng làm mṍt hoạt đụ̣ enzyme. Muụ́i có trọng lượng phõn tử bộ bị giữ lại, các protein có trọng lượng phõn tử lớn xuụ́ng trước
Giai đoạn tiờ́p theo là làm đụng khụ thành bụ̣t trắng. Chuyờ̉n trạng thái từ dịch nước đá sang trạng thái khí mà khụng qua trạng thái lỏng.
Đờ̉ tiợ̀n lợi người ta đưa ra cụng thức đờ̉ tính lượng (NH4)2SO4 cho vào dung dịch đã có đụ̣ bão hòa cho trước (S1) đờ̉ đạt đờ́n mụ̣t đụ̣ bão hòa cõ̀n thiờ́t (S2)
Tùy theo trạng thái (NH4)2SO4 cho thờm vào dung dịch chiờ́t protein, mà có cụng thức tính toán khác nhau.
- Đụ́i với (NH4)2SO4 ở dạng bụ̣t
0,515 x V (S2 - S1) x (g) =
1 - 0,272 x S2 Trong đó:
- V là thờ̉ tích dung dịch - S1 là đụ̣ bão hòa cho trước
- S2 và đụ̣ bão hòa cõ̀n đạt. (ví dụ S1= 0,5 và S2= 0,7 chẳng hạn)
Người ta cũng có thờ̉ dùng bản đụ̀ toán (nomogram) đờ̉ chiờ́u và xác định được lượng (NH4)2SO4 thờm vào đờ̉ dung dịch protein đạt được mụ̣t đụ̣ bão hòa nhṍt định. Hoặc có thờ̉ đụ́i chiờ́u ở bảng có sẵn.
Lượng (NH4)2SO4 đưa vào đờ̉ dung dịch có đụ̣ bão hòa nhṍt định có khác nhau tùy thuụ̣c nhiợ̀t đụ̣ thí nghiợ̀m.
- Đụ́i với (NH4)2SO4 ở dạng dung dịch bão hòa. Thờ̉ tích (tính theo ml) của dung dịch bão hòa cõ̀n cho vào 100ml dung dịch có đụ̣ bão hòa ban đõ̀u S1 đờ̉ đạt đờ́n mụ̣t đụ̣ bão hòa S2 cõ̀n thiờ́t được tính theo cụng thức sau: