. Phối hợp cho từng chỉ định điều trị:
1. Cán bộ chuvên khoa:
- 1 bác sĩ chuyên khoa giải phẫu bệnh có kinh nghiệm và hiểu biết sâu về hóa mô miễn dịch.
- 1 kĩ thuật viên giải phẫu bệnh.
2. Phương tiện:
- Dụng cụ, máy m óc: Micropipette (từ 1 p.1 đến 1000 JJ.1), pipet (từ lm l đến 10m l), các ống nghiệm (từ 50m l đến 1000m l), cân điện tử, nồi áp suất chuyên dụng, lò vi sóng, máy đo pH, hộp ủ tiêu bản, tủ ấm, tủ lạnh, máy cắt vi thể, máy cắt lạnh, bếp điện, bát nhuộm, lam kính, lamen.
- Hóa chất: Silane, kháng thể, các kít phát hiện, Diam ino-Benzidin, Hematoxylin, nước cất, cồn 90°, cồn tuyệt đối, dung dịch Xitrat- Buffer pH 6, dung dịch Tris- Buffer- Salin (TBS) pH 7.6, dung dịch pha kháng thể, dung dịch H20 2.
IV. C Á C B Ư Ớ C T IÊ N H À N H
1. Chuẩn bị tiêu bản: bệnh phẩm cát mỏng 3-4 |j.m đặt trên lam kính đã được xử lí nhúng với dung dịch Silane. Tiêu bản phải được đặt trong tủ ấm 6 0 ° c ít nhất là 1 giờ.
2. Tẩy paraĩin theo thường quy rồi nhúng vào nước cất 2 lần X 5 phút. 3. Khử peroxidase nội sinh bằng dung dịch H20 2 3% 2 lần X 2 phút.
4. Bộc lộ kháng nguyên bằng cách nhúng tiêu bản trong dung dịch citrat buffer pH 6 rồi đun cách thủy trong nồi áp suất. Kiểm tra nhiệt độ của dung dịch xitrat buffer khi đạt trên 9 0 °c , đậy vung và tiếp tục đun thêm 5 đến 7 phút (có thể dùng các phương pháp khác nhau để bộc lộ kháng nguyên).
5. Tiêu bản được để nguội dần 20 phút rồi nhúng vào nước cất 2 lần X 2 phút. 6. Rửa tiêu bản bằng dung dịch Tris- Buffer- Saline (T B S) pH 7,6 X 5 phút.
7. Khử các protein không đặc hiệu bằng huyết thanh ngựa 1% X 5 phút, sau không được rửa.
8. Phủ kháng thể thứ nhất (primary antibody) X 60 phút. 9. Rửa T B S 2 lần X 5 phút.
10. Phủ kháng thể thứ hai gắn Biotin (Biotinylated secondary antibody) X 30 phút. 1 l ệ Rửa T B S 2 lần X 5 phút.
12. Phủ phức hợp Avidin- Biotin có gắn HRP (A BC/H RP), hoặc Avidin-Avidin/HRP, hoặc Streptavidin/HRP trong 30 phút.
13. Rửa T B S 2 lần X 5 phút.
14. Phủ dung dịch diamino benzidine (D A B) trong 10 phút. 15. Rửa nước chảy trong 5 phút.
16. Nhuộm hematoxylin trong 30 giây. 17. Khử nước, làm sạch tiêu bản, gắn lamen. V. Đ Ọ C K Ế T Q U Ả
- Đọc kết quả trên kính hiển vi quang học: phản ứng dương tính có mầu nâu đỏ ở nhân, bào tương hoặc màng tế bào tùy từng loại kháng nguyên.
- Nếu nhuộm trên tiêu bản cắt lạnh:
+ Chuẩn bị tiêu bản: bệnh phẩm cắt mỏng 3- 4 ịim đặt trên lam kính đã được xử lí nhúng với dung dịch Silane.
+ Tiêu bản được ngâm trong nước cất 5 phút.
+ Khứ peroxidase nội sinh bằng dung dịch H20 2 3% X 5 phút. + Rửa nước cất 2 lần X 5 phút.
+ Các bước nhuộm tiếp theo như đối với tiêu bản parafin (từ bước 6 đến 18).
2 ề SINH TH I ẾT C Ắ T LẠNH
|ế ĐẠI CƯƠNG
- Sinh thiết cắt lạnh còn gọi là sinh thiết tức thì là một phương pháp chẩn đoán mỏ bệnh học ngay trong lúc phẫu thuật trên các tiêu bản được cắt từ máy cắt lạnh (Cryostat). 202
Chương IX: Ung b ư ớ u
Phương pháp này đã giúp cho các nhà phẫu thuật có một thái độ xử lí đúng đắn, làm giảm số lần phau thuật, rút ngắn thời gian điều trị, góp phần quan trọng trong chẩn đoán và điều trị ung thư.
- Sinh thiết tức thì là phương pháp chẩn đoán có độ chính xác cao, có thể áp dụng rộng rãi tại các cơ sở điều trị ngoại khoa lớn, đặc biệt là ở các trung tâm điều trị ung thư.
II. CHỈ ĐỊNH
Trong các trường hợp:
1. Phẫu thuật tiệt cãn nhưng chưa có chẩn đoán xác định là ung thư. 2. Phẫu thuật thăm dò nhằm quyết định hướng điều trị tiếp theo. 3. X ác định diện phẫu thuật xem còn tế bào ung thư hay không. 4. Làm tiêu bản cắt lạnh nhuộm hóa mô miễn dịch.
III. CHUẨN BỊ
1. Cán bộ chuyên khoa:
- 1 bác sĩ giải phẫu bệnh có kinh nghiệm. - 1 kĩ thuật viên giải phẫu bệnh.
2ẻ Phương tiện:
- Máy cắt lạnh, thường đặt ở nhiệt độ -25 đến -3 0 °c. - Chất keo chuyên dụng gắn bệnh phẩm.
- Lam kính, lamen, thuốc nhuộm xanh toluidin, hematoxylin và eosin, cồn, toluen ..ẵ - Bệnh phẩm: tổn thương được lấy ra trong lúc phẫu thuật không được cố định mà phải chuyển ngay đến phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh. Bệnh phẩm phải có kích thước tối thiểu 0,5cm đường kính.
IVế CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Bác sĩ giải phẫu bệnh sau khi nhận bệnh phẩm phải xem kĩ đại thể: kích thước, mật íộ, tính chất đê có chẩn đoán sơ bộ.
2. Cắt bệnh phẩm để lấy một mảnh đại diện (nếu là bệnh phẩm to) kích thước khoảng :hừng 1 X 1 X 0,2cm . Lấy hết bệnh phẩm nếu là bệnh phẩm nhỏ.
3. Đật bệnh phẩm lên giá đỡ bệnh phẩm, nhỏ chất keo xung quanh bệnh phẩm.
4. Đặt giá bệnh phẩm vào vị trí làm lạnh trong máy, đợi 1 - 2 phút đến khi bệnh phẩm !ông cứng.
5. Đặt giá bệnh phẩm vào vị trí, cắt tiêu bản mỏng từ 3 đến 5 |im, gắn các lát cắt lên am kính (làm 2 tiêu bản, 1 đê nhuộm xanh toluidin, 1 để nhuộm HE).
6. Nhuộm xanh toluidin 10- 20 giây,