IV. SỰ PHÂN LOẠI SINH GIỚ
4. Côngnghệ sinh học tế bào ng−ời và động vật
CNSH tế bào ng−ời và ĐV hiện nay bao gồm các lính vực chủ yếu nh− nuôi cấy các tế bào, tạo kháng thể đơn dòng, cấy ghép cơ quan và cấy phôi, tạo dòng vô tính ĐV, tế bào gốc, các ph−ơng pháp sinh sản nhân tạo…Tuy ra đời chậm hơn so với CNSH VSV nh−ng nó có nhiều ứng dụng liên quan trực tiếp đến con ng−ời nên phát triển mạnh và nhanh với các đặc điểm:
- Kỹ thuật phức tạp và khó thực hiện.
- Đáp ứng nhiều nhu cầu cấp thiết cho phòng và chữa trị bệnh.
- Nhiều phát minh ở Đv rất dễ ứng dụng cho ng−ời nên là những vấn đề nhạy cảm đối với d− luận xã hộị
- Nhiều ứng dụng trong chăn nuôị
4.1. Nuôi cấy tế bào động vật
Từ năm 1907, nuôi cấy tế bào ĐV in vitro làn đầu tiên đ−ợc chứng minh có khả năng thực hiện. Đến năm 1949, J.F. Enders nuôi mô ĐV thành công và đã cho thấy virus gây bại liệt có thể phát triển trong các tế bào nuôi in vitrọ
Đầu thập niên 1950, tế bào ĐV có vú đ−ợc nuôi với số l−ợng lớn để nuôi nhiều virus bại liệt dùng chế vaccine chống bệnh bại liệt. Sau đó việc nuôi các tế bào ng−ời đ−ợc phát triển để nhân các virus khác và sản xuất các protein đặc hiệu nh− kháng thể và interferon.
Nuôi tế bào ĐV có vú là một trong những lĩnh vực phát triển mạnh của CNSH. Nó đ−ợc ứng dụng chủ yếu vào các lĩnh vực nh− sản xuất vaccine virus, các protein, hormon trị liệu, sản xuất các kháng thể đơn dòng. Nó có thể góp phần phục hồi các cơ quan bị th−ơng tổn hay chế tạo các cơ quan nhân tạo trong Y học phục hồị
4.2. Những khó khăn trong việc nuôi cấy tế bào động vật có vú
- Sinh sản rất chậm: tế bào ĐV có vú cần 15 đến 40 giờ để tăng gấp đôi số l−ợng, trong khi các vi khuẩn chỉ cần vài chục phút hay nhiều lằm là 1-2 giờ. Quá trình sản xuất đòi hỏi nhiều ngày, thậm chí vài tuần.
- Rất nhạy cảm với các yếu tố môi tr−ờng nuôi cấy nh− chỉ chịu đựng đ−ợc nhiệt độ trong một giới hạn rất hẹp giữa 35-39P
o
P
C.
Tế bào ĐV có vú có nhu cầu dinh d−ỡng hết sức phức tạp. Yếu tố hàng đầu là phải chọn môi tr−ờng dinh d−ỡng tốt nhất cho tăng tr−ởng và sinh sản của tế bào khi tách mô khỏi cơ thể.
* Môi tr−ờng nuôi tự nhiên:
Do sự phức tạp của môi tr−ờng dinh d−ỡng nuôi tế bào ĐV có vú nên có thể dùng ngay các môi tr−ờng tự nhiên nh− các cục máu đông, dịch huyết t−ơng, n−ớc ối bào thai…
* Môi tr−ờng nuôi tổng hợp:
Một thành phần không thể thiếu đ−ợc cho tất cả các loại môi tr−ờngtổng hợp là huyết t−ơng của máu, chiếm khoảng 5-10%. Tất cả các môi tr−ờng tổng hợp đều phải có thêm thành phần cơ bản là dung dịch sinh lý hay dung dịch muối cân bằng gồm hỗn hợp các muối vô cơ, có chức năng duy trì pH, áp suất thẩm thấu và cung cấp chất vô cơ.
* Các thành phần cơ bản của môi tr−ờng:
Môi tr−ờng dinh d−ỡng phải thỏa mãn các điều kiện: - Có đủ những ion vô cơ cần thiết (Na, Ca, K…). - áp suất thẩm thấu phải chính xác.
- pH phải chính xác (th−ờng đ−ợc giữ ở 7-7,3). - Nguồn năng l−ợng lấy từ glucosẹ
- Có phenol để dễ theo dõi pH.
Th−ờng môi tr−ờng chứa 5-10% huyết t−ơng bò con (trong bụng mẹ).
Giữ pH ổn định rất khó nên cần dung dịch đệm, ngoài ra còn thêm sodạ Việc duy trì l−ợng COB2B (5%) ở một áp suất hợp lý là yếu tố không thể thiếu đ−ợc. Nếu môi tr−ờng càng giàu dinh d−ỡng thì càng dễ nhiễm VSV khác nên trong môi tr−ờng nuôi phải thêm chất kháng vi khuẩn và nấm (penicilin diệt khuẩn, nystatin diệt nấm…).
4.4. Quy trình khái quát và cách xử lí thu các loại sản phẩm
Các tế bào nuôi
Pha loãng trong môi tr−ờng Lấy môi tr−ờng gạn dung dịch ra và axit butyric
Lấy môi tr−ờng kiệt Thêm môi tr−ờng duy trì Tinh sạch, cô đặc chất dinh d−ỡng ra
Cho vào môi tr−ờng Virus sống Kháng thể, hormon kích thích tạo interferon
Tách tế bào Thử
Quá trình sản xuất công nghiệp gồm: Dòng sơ cấp ặ Nhân giống ặ Sản xuất lớn ặ Sản phẩm ặ ứng dụng. Tùy mục đích ứng dụng mà các công đoạn sản xuất có khác nhaụ
4.5. Các ứng dụng của nuôi tế bào động vật
Nuôi cấy tế bào ĐV có vú và ng−ời ngày càng đ−ợc phát triển vì nó tạo ra nhiều chế phẩm thiết yếu trong y d−ợc.
- Sản xuất vaccine virus: đến nay một số vaccine chủ yếu đã đ−ợc sản xuất: + Vaccine chống bệnh bại liệt, viêm gan virus B.
+ Vaccine chống bệnh quai bị, bệnh sởi, bệnh daị
+ Vaccine chống 1 loại virus gây bệnh sán lá ở động vật. + Vaccine chống lở mồm, long móng ở gia súc.
- Sản xuất các protein nh− interferon, kháng thể và các hormon dùng trị liệụ - Sản xuất các protein tái tổ hợp bằng chuyển gen.
- Các chế phẩm miễn dịch chủ yếu đ−ợc sản xuất là các kháng thể đơn dòng, các kháng thể này dùng cho chẩn đoán bệnh, thuốc đúng mục tiêu chữa trị (VD: các tế bào ung th−) và dùng trong nghiên cứụ
- Các hormon nh− hormon tăng tr−ởng của ng−ời, prolactin đ−ợc sản xuất bằng nuôi tế bàọ
- Sản xuất virus diệt côn trùng bằng nuôi tế bào côn trùng và cho nhiễm virus rồi thu chế phẩm.
Đặc biệt, gần đây các tế bào gốc đ−ợc nuôi để dùng trong liệu pháp tế bào, nhằm đ−a tế bào bình th−ờng thay thế tế bào bệnh.
Ch−ơng IV:
sinh học phân tử và công nghệ sinh học ứng dụng trong một số lĩnh vực
1. Sinh học phân tử trong y tế
Các ứng dụng của sinh học phân tử thể hiện sớm nhất và rõ nhất trong ngành ỵ Ngày nay, với những công cụ của kĩ thuật gen, y khoa không còn chỉ dựa vào các triệu chứng lâm sàng mà còn có khả năng tác động thẳng vào nguyên nhân sâu xa của bệnh: sự bất th−ờng của gen. Sinh học phân tử xâm nhập vào hầu nh− mọi lĩnh vực của y tế ; trong đó, phát triển mạnh nhất phải kể đến lĩnh vực chẩn đoán và phòng ngừa với việc tạo ra các vaccine hiệu quả caọ Lĩnh vực sản xuất các chất chữa bệnh (interferon, protein có hoạt tính sinh học nh− insuline,…) ngày càng phát triển mạnh trở thành một công nghiệp phồn thịnh. Và đặc biệt, liệu pháp gen mặc dù thành tựu còn hạn chế đã mở ra những triển vọng to lớn trong việc chữa trị những bệnh di truyền.
1.1. Chẩn đoán phân tử
1.1.1. Chẩn đoán các rối loạn di truyền
Tr−ớc kia, việc chẩn đoán rối loạn di truyền chỉ dựa vào các chỉ tiêu lâm sàng và các thử nghiệm sinh hoá. Chỉ tiêu lâm sàng đôi khi không rõ ràng và không đặc tr−ng cho bệnh; hơn nữa nhiều rối loạn di truyền tiến triển rất chậm chỉ có thể phát hiện đ−ợc sau nhiều năm. Thử nghiệm sinh hoá nhiều lúc cho kết quả không chính xác, phải qua nhiều kiểm tra lau và đắt tiền. Đặc biệt, các biện pháp này không thể dùng để xác định ng−ời lành mang mầm bệnh hay khi cần chẩn đoán trên thai nhi
Sinh học phân tử với tính đặc hiệu cao, về nguyên tắc có thể giải quyết đ−ợc các vấn đề vừa nêụ
Các kỹ thuật sinh học phân tử thông dụng nhất trong chẩn đoán là ph−ơng pháp Southern blot và PCR. Tr−ờng hợp gen bệnh đã đ−ợc xác định và tạo dòng, nó sẽ đ−ợc sử dụng làm mẫu dò để phát hiện trực tiếp gen bệnh trên bộ gen trong ph−ơng pháp Southern blot. Trình tự đã biết của gen cũng cho phép tổng hợp các mồi chuyên biệt dùng trong ph−ơng pháp PCR. Tr−ờng hợp gen bệnh ch−a đ−ợc xác định thì ng−ời ta phải sử dụng mẫu dò “vô danh” cho phép phát hiện các biến đổi (các dạng đa hình – polymorphism) trong vùng lân cận và liên kết với gen cần chẩn đoán. Các dạng đa hình này đ−ợc xác định qua các nghiên cứu phả hệ; bộ gen của các thành viên trong gia đình ng−ời bệnh sẽ đ−ợc phân tích để tìm ra dạng đa hình có liên kết với gen đột biến.
Chẩn đoán gen có hai h−ớng ứng dụng chính: chẩn đoán các bất th−ờng bẩm sinh và chẩn đoán các bất th−ờng của DNA sinh d−ỡng
1.1.2. Chẩn đoán phát hiện các tác nhân gây ngoại lai
Trong việc phát hiện tác nhân gây bệnh, sử dụng các ph−ơng pháp sinh học phân tử có nhiều thuận lợi hơn so với các ph−ơng pháp cổ điển. Thứ nhất, tiết kiệm đ−ợc thời gian vì không cần nuôi cấy tác nhân gây bệnh, điều này đặc biệt đúng khi sử dụng ph−ơng pháp PCR. Thứ hai, các ph−ơng pháp sinh học phân tử là biện pháp duy nhất khi tác nhân gây bệnh không thể hay khó nuôi cấy, nh− trong tr−ờng hợp của trực khuẩn Koch, Brucella, Chlamydia, HBV (Hepatitis B virus – virus viêm gan siêu vi B) ; điều này th−ờng thấy ở các tác nhân là virus. Thứ ba, việc tạo dòng một gen dùng làm mẫu dò đơn giản hơn việc sản xuất kháng thể chuyên biệt; hơn nữa với một mẫu dò ng−ời ta có thể phát hiện tất cả các kiểu huyết thanh (serotype) của tác nhân gây bệnh, điều mà chỉ một huyết thanh kháng thể không làm đ−ợc. Cuối cùng, nếu tr−ớc kia phải cần đến nhiều kỹ thuật (quan sát d−ới kính hiển vi, nuôi cấy trên một loại môi tr−ờng, miễn dịch học,…) thì h−ớng chẩn đoán bằng sinh học phân tử chỉ cần một (lai phân tử hoặc PCR).
1.2. Sản xuất các chất phòng và chữa bệnh
đây là lĩnh vực ứng dụng mạnh nhất của sinh học phân tử với sự phát triển của hàng loạt công nghiệp sản xuất các chất có đặc tính phòng và trị bệnh, bao gồm các protein có hoạt tính sinh học, các kháng thể đơn dòng đặc biệt là các vaccinne, và thuốc kháng sinh
1.2.1. Các kháng sinh
Bao gồm hơn 2500 loại, các kháng sinh có cấu trúc phân tử cực kỳ đa dạng. Chúng đ−ợc sản xuất chủ yếu do các xạ khuẩn (Actinomyceter). Các kháng sinh thuộc loại các chất chuyển hoá thứ cấp (secondary metabolite), tức là các chất đ−ợc vi sinh vật sản sinh trong giai đoạn trễ của quá trình tăng tr−ởng, nên các con đ−ờng sinh tổng hợp cũng nh− điều hoà sinh tổng hợp của chúng cho đén gần đây cũng ch−a đ−ợc hiểu biết toàn bộ.
Để tăng năng xuất tạo kháng sinh, tr−ớc kia ng−ời ta sử dụng hai biện pháp: (1) gây tạo đột biến ngẫu nhiên và chọn lọc dòng cho năng suất cao nhất, tiến trình đ−ợc lặp đi lặp lại nhiều lần với đủ loại tác nhân gây đột biến; (2) thử nghiệm đủ loại môi tr−ờng và chọn môi tr−ờng thích hợp nhất cho loại kháng sinh cần sản xuất. Cả hai biện pháp đều cho kết quả tốt nh−ng đòi hỏi lao đọng nặng nhọc và thời gian dàị Với các kỹ thuật sinh học phân tử, ng−ời ta có thể tạo dòng toàn bộ các gen có tham gia vào quá trình sản xuất kháng sinh; từ đó xác định đ−ợc số l−ợng các b−ớc của quá trình sinh tổnn hợp và snả phẩm của từng b−ớc. Ng−ời ta còn có thể thay đổi biểu hiện của từng gen tạo dòng và điều khiển từng b−ớc của quá trình sinh tổng hợp theo ý muốn
1.2.2. Các vaccine
Các vaccine có nguồn gốc vi khuẩn: Tr−ớc kia đ−ợc sản xuất từ các ngoại độc tố (exotoxin) vi khuẩn đ−ợc xử lý để loại độc tính hoặc từ vi khuẩn chết, rất hiếm khi từ vi khuẩn sống đã đ−ợc làm giảm độc tính. Biện pháp này gặp một số bất lợi nh− hiện t−ợng phục hồi độc tính ban đầu hoặc sự phân huỷ không hoàn toàn các độc tố dễ dẫn đến hiệu ứng không mong muốn ở ng−ời đ−ợc tiêm chủng, việc sử dụng vi khuẩn chết lại đòi hỏi phải tiêm lặp lại nhiều lần vì tính miễn dịch không caọ Biện pháp tỏ ra có nhiều −u điểm hơn là tạo vaccine tái tổ hợp nh− tr−ờng hợp ở Vibriocholerae, ng−ời ta loại bỏ một phần gen enterotoxin của vi khuẩn tr−ớc khi dùng chúng để sản xuất vaccinẹ Kết quả là protein sinh ra có độc tính giảm đáng kể mà vẫn giữ tính kháng nguyên caọ
Các vaccine có nguồn gốc virus: Có lẽ ngoài kháng sinh thì đây là sản phẩm y tế đóng góp nhiều nhất cho sức khoẻ con ng−ờị Chỉ riêng vaccine chủng ngừa đậu mùa đã giúp nhân loại vĩnh viễn loại bỏ tác hại do virus này gây ra ở quy mô toàn thế giớị Tr−ớc đây, ng−ời ta sản xuất vaccine từ virus đã đ−ợc làm yếu đi hoặc từ virus chết và cũng vấp phải vấn đề về mức độ an toàn của vaccine : virus không bị giết chết hoàn toàn hoặc tái lập độc tính ban đầụ Kỹ thuật tái tổ hợp DNA có thể giúp giải quyết khó khăn này và đặc biệt hữu hiệu trong tr−ờng hợp các virus khó hay không thể nuôi cấỵ
1.2.3. Các kháng thể đơn dòng
Các ứng dụng của kháng thể đơn dòng rất đa dạng, bao gồm các kháng thể đơn dòng dùng trong chẩn đoán (ung th−, bệnh truyền nhiễm,…), trong các thử nghiệm sinh hoá (kháng nguyên nhóm máu, progesterone, oestrogen,…), trong trị liệu (giảm các nguy cơ do việc ghép tuỷ x−ơng, trị ung th−,…). Một lĩnh vực ứng dụng độc đáo là trong trị liệu ung th−. Kháng thể đơn dòng đ−ợc sử dụng kết hợp với một độc tố trong kỹ thuật độc tố miễn dịch (immunotoxin) hay với một đồng vị phóng xạ trong liệu pháp miễn dịch phóng xạ (radioimmunotherapy).
1.2.4. Các protein có hoạt tính sinh học
ở bệnh di truyền th−ờng có biểu hiện thiếu hụt hay mất hẳn một protein quan trọng do gen bị bất loạn. Trong khi chờ đợi liệu pháp gen phát triển đủ để thay thế gen bệnh bằng gen lành, biện pháp điều trị duy nhất hiện nay là cung cấp cho bệnh nhân protein bị thiếụ Giải pháp tối −u là sử dụng protein có nguồn gốc từ ng−ời thì hiện nay đang vấp phải những khó khăn lớn về số l−ợng và chất l−ợng.
1.3. Liệu pháp gen
Trong các h−ớng ứng dụng của sinh học phân tử vào y học, liệu pháp gen đối với các dối loạn di truyền mở ra nhiều triển vọng nhất đồng thời cũng là h−ớng ứng dụng khó thực hiện nhất. Liệu pháp gen với hai biện pháp, đ−a gen lành vào cơ thể bù đắp cho gen bệnh hay thay gen bệnh bằng gen lành, đều vấp phải những khó khăn về mặt lý thuyết, ph−ơng pháp luận và cả về tính đạo lý của vấn đề.
ạ Các b−ớc cơ bản trong liệu pháp gen
Trong b−ớc 1: ng−ời ta tạo thành các vector tái tổ hợp có mang gen cần chuyển.
Qua b−ớc 2: các vector virus có mang gen lành đ−ợc d−a vào cơ thể mà từ đó ng−ời ta đã tách các tế bào tuỷ x−ơng để chuyển gen.
b. Các mô hình rối loạn di truyền ở ng−ời có thể đ−ợc giải quyết bằng liệu pháp gen
Tr−ớc tình hình phát triển nghiên cứu trong lĩnh vực liệu pháp gen, lần đầu tiên, Hội nghị Hợp chủng quốc Hoa Kỳ (1984) d−ới sự điều khiển của một Hội đồng khoa học
đã đ−a ra một số quan điểm về tính khoa học, kỹ thuật và đạo lý của vấn đề nàỵ Các quan điểm này sau đó đã đ−ợc toàn bộ cộng đồng khoa học quốc tế chấp nhận, bao gồm một số điểm sau:
- Gen bệnh phải không là gen trội so với gen sẽ đ−ợc ghép
- Biểu hiện của gen ghép phải ổn định, có tính đặc hiệu tế bào và tế bào chuyển gen phải tồn tại đ−ợc sau khi sau khi đ−ợc cấy vào cơ thể
- Các thử nghiệm lâm sàng phải đ−ợc thực hiện tr−ớc tiên trên mô hình động vật và kết quả thu nhận đ−ợc phải có tính lặp lại ổn định
- Quy trình thực hiện phải đảm bảo an toàn, nghĩa là phải tránh đ−ợc các t−ơng tác có thể xuất hiện giữa tế bào đ−ợc ghép gen và dòng tế bào sinh dục, cũng nh− tránh mọi khả năng gây ung th− do vector virus hoạt hoá một gen tiền ung th−
- Liệu pháp gen chỉ đ−ợc áp dụng cho những tr−ờng hợp hoàn toàn không thể chữa trị bằng bất cứ ph−ơng pháp náo khác
- Mọi thử nghiệm ở ng−ời đều phải thông qua một uỷ ban đặc biệt có trách