IV. SỰ PHÂN LOẠI SINH GIỚ
5. Các ph−ơng pháp xác định trình tự axit nucleic 1 Ph−ơng pháp hoá học của Maxam – Gilbert
5.1. Ph−ơng pháp hoá học của Maxam – Gilbert
Nguyên tắc của ph−ơng pháp hoá học của Maxam – Gilbert là sử dụng ph−ơng pháp đánh dấu phóng xạ (P32), sử lý hoá học để phá huỷ 1 nuclêotit tạo ra hàng loạt các đoạn ADN có kích th−ớc khác nhaụ
Các khâu trong ph−ơng pháp Maxam – Gilbert: (1). ADN sợi kép biến tính thành dạng sợi đơn. (2). Đánh dấu phóng xạ (P32) ở đầu 5’
(3). Sử dụng bốn loại hoá chất khác nhau, mỗi loại hoá chất chỉ phá huỷ một loại nuclêotit nhất định và tiến hành bốn phản ứng độc lập, kết quả tạo ra các đoạn ADN kích th−ớc khác nhaụ
(4). Sản phẩm của bốn phản ứng đ−ợc tiến hành điện di trên Gel poliacrylamid. Trình tự nuclêotit đ−ợc đọc từ d−ới lên theo chiều từ 5’ 3’.
5.2. Ph−ơng pháp Sanger
Nguyên tắc của ph−ơng pháp này là sử dụng deoxynucleotit không có nhóm OH ở vị trí 3’, do vậy trong quá trình kéo dài chuỗi polinucleotit enzyme polimerase gắn chúng vào chuỗi polinucleotit thì quá trình tổng hợp bị dừng lạị Kết quả tạo ra các đoạn ADN có kích th−ớc kớn hơn kém nhau một nucleotit, trên cơ sở đó xác định đ−ợc trình tự nucleotit.
Các khâu của ph−ơng pháp Sanger:
(1). Biến tính ADN sợi kép thành ADN 2 sợi đơn. (2). Mồi tiếp hợp với ADN sợi đơn.
(3). Phản ứng tổng hợp chuỗi polinucleotit gồm : ADN sợi khuẩn, primer, ADN polimerase và dNTP. Sự gắn dNTP mất nhóm OH ở vị trí 3’ vào chuỗi polinucleotit làm quá trình tổng hợp bị dừng lạị
(4). Điện di trên Gel poliacrylamid sẽ xác định đ−ợc trình tự của đoạn ADN. 6. Ph−ơng pháp PCR
6.1. Nguyên tắc của phản ứng
- Cơ chế tái bản của ADN theo Okazaki ở Ecoli:
Hiện t−ợng biến tính ADN do tác động của enzym
Có mồi ARN ngắn
Tổng hợp theo chiều 5’ đến 3’
- Quá trình tái bản ADN mạch kép phải đ−ợc diễn ra đồng thời từ hai mạch khuôn, cả hai mạch đều cần mồị
- Phản ứng chuỗi PCR đ−ợc thực hiện khi có các thành phần sau đây:
DNA mẫu
Hai đoạn mồi ( mỗi đoạn dài khoảng 18- 30 base)
Enzyme: Taq polymerase
Bốn loại deoxyronucleotit triphotphat.
Dung dịch đệm và ion MgP
2+
P
.
Phản ứng chuỗi đ−ợc thực hiện trên thiết bị nhân DNẠ
6.2. Các b−ớc phản ứng
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhaụ Mỗi chu kỳ gồm 3 b−ớc: B−ớc 1: giai đoạn biến tính
Trong 1 dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đ−ợc biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, th−ờng là ở 94- 95P
o
P
c trong vòng 30 giây – 1 phút.
B−ớc 2: Giai đoạn gắn mồi
Nhiệt độ hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này dao động khoảng 40- 65P
o
P
c và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút, tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng. 94 – 950C 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 40- 65P 0 P C 3’ 5’ 3’ 5’
5’5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ B−ớc 3: Giai đoạn kéo dài
Nhiệt độ 72P
o
P
c DNA Taq polimerase hoạt động kéo dài đoạn DNA từ dạng mồi và 2 đoạn mới đ−ợc tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ 2 đầu đoạn DNA khuôn ban đầụ
Sau 1 chu kỳ gồm 3 giai đoạn nh− trên, một đoạn DNA khuôn đ−ợc nhân lên thành 2, các đoạn DNA đ−ợc nhân bản trong mỗi chu kỳ lại đ−ợc coi là DNA khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theọ Chính vì vậy sau k chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2P
k
P
đoạn DNA giống đoạn DNA khuôn ban đầụ
* Kiểm tra sản phẩm của phản ứng PCR
Tiến hành bằng ph−ơng pháp điện di trên Gel agarose 0.8 – 2%. Tiến hành chụp ảnh trên ánh đèn UV để xác định sự có mặt của đoạn DNA đ−ợc nhân bởi PCR.
6.3. Các chỉ tiêu ảnh h−ởng 6.3.1. DNA khuôn (Template)
DNA khuôn là vật liệu khởi đầu cho phản ứng PCR nên đời hởi có độ tinh sạch caọ DNA khuôn có thể là sợi đơn hoặc sơi đôi của chuỗi DNA đ−ợc biết tr−ớc trình tự ở hai đầu để thiết kế mồị Thông th−ờng, nồng độ của DNA khuôn đ−ợc đ−a vào phản ứng khoảng 10 – 500 ng. 6.3.2. Enzyme 72P 0C P 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ Sản phẩm đ−ợc hình thành sau Sản phẩm cuối cùng của phản ứng PCR
Enzyme Taq polimerase là enzym chịu nhiệt đ−ợc tách từ vi khuẩn suối n−ớc nóng Thermus aquaticus, Taq có trọng l−ợng phân tử là 94 kDa và không mất hoạt tính ở nhiệt độ cao trong giai đoạn gây biến tính DNẠ Hoạt tính của Enzyme Taq giảm 50% sau 150 phút ở nhiệt độ 92,5P 0 P c, sau 40 phút ở nhiệt độ 95P 0 P c và sau 5 – 6 phút ở nhiệt độ 97P 0 P c.
Nồng độ enzyme Taq tối −u cho phản ứng PCR là 0,5 – 2,5 đơn vị; nh−ng nếu nồng độ ezyme quá cao sẽ làm giảm hiệu suất xúc tác của phản ứng.
6.3.3. Mồi và nhiệt độ lai
Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt đ−ợc một sự khuếch đại đặc tr−ng và có hiệu quả caọ Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của ph−ơng pháp PCR, và phải tuân thủ một số nguyên tắc:
- Trình tự của mồi đ−ợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi: và mồi “ng−ợc”, và cũng không có những cấu trúc “kép tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các thành phần khác nhau của một mồị
- Tm của mồi xuôi và mồi ng−ợc không cách biệt quá xạ Thành phần nucleotid của các mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần.
- Các cặp mồi chọn phải đặc tr−ng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen.
- Trình tự nằm giữa hai mồi “xuôi” và “ng−ợc” không quá lớn; phản ứng PCR sẽ tối −u trên những trình tự nhỏ hơn 1kb.
6.3.4. Các thành phần khác của phản ứng PCR
Các nucleotit (dNTPs): dNTPs là hỗn hợp của 4 loại deoxyronucleotit (dATP, dTTp, dGTP, dCTP) làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNẠ Tuỳ thuộc vào mục đích nghiên cứu, các nhà khoa học còn có thể sử dụng một số nucleotit đã đ−ợc thay đổi nh− gắn thêm biotin hoặc digoxygenin…
Số chu kỳ phản ứng:Trong thực tế, ng−ời ta không v−ợt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng PCR.
6.4. ứng dụng của PCR
Các ứng dụng của phản ứng PCR bao trùm nhiều lĩnh vực của nghiên cứu và đời sống. PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích genome của sinh vật, vì nó có khả năng tạo ra một l−ợng lớn các trình tự DNA đặc hiệu từ bất kỳ cơ thể nàọ
PCR đ−ợc sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau nh− xác định trình tự trực tiếp của DNA đ−ợc nhân bản, thiết kế các trình tự DNA mới, nhân bản quần thể DNA để làm mẫu lai, xác định các trìhn tự đặc hiệu từ cDNA hay th− viện gen, phân tích tiến hoá và sự đa dạng DNA của quần thể sinh vật hay giữa các cá thể.
Hiện nay, PCR đ−ợc xem là ph−ơng pháp nhanh, chónh xác và t−ơng đối đơn giản để đánh giá cây chuyển gen, phân tích một cách nhanh chóng sự biến dị di truyền ở cấp độ phân tử DNA trong phạm vi quần thể và giữa các cá thể.
PCR đ−ợc ứng dụng để phát hiện nhanh các đột biến điểm và phân tích DNA đa hình. PCR còn đ−ợc ứng dụng phân lập gene, phân tích sinh vật chuyển gene
7. Các enzym thông dụng trong kỹ thuật di truyền
7.1. Enzym giới hạn
Enzym là những protein hoạt tính sinh học và dựa vào loại phản ứng xúc tác mà trong sinh học phân tử có thể chia enzym thành nhiều nhóm khác nhaụ Trong đó các enzym nhóm enzym giới hạn, enzym polimerase, enzym nối, các enzym nuclease đ−ợc quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong các lĩnh vực của sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền.
Enzym giới hạn (cắt hạn chế) là loại enzym nuclease có khả năng nhận biết đ−ợc điểm cắt và cắt tại điểm xác định.
7.1.2. Các nhóm enzym giới hạn
Các enzym giới hạn có 3 nhóm I, II, III và các enzym giới hạn đ−ợc dùng phổ biến ngày nay thuộc nhóm IỊ Enzym giới hạn nhóm II có cơ chế tác động đơn giản nhất, chúng là các nuclease, và vì chúng cắt tại một vị trí nằm bên trong sợi ADN và không phân huỷ ADN từ hai đầu nên gọi là endonucleasẹ
Đặc điểm của các loại enzym giới hạn
Đặc điểm Nhóm I Nhóm II Nhóm III Điểm cắt Xa điểm nhận biết hơn 1000bp Nằm trong điểm nhận biết Nằm ngoài điểm nhận biết
Khả năng methyl hoá
gốc Adenine Có Không Có
Điều kiện để cắt ATP, MgP
++P MgP P MgP ++ P hoặc MnP ++ P MgP ++ P Cấu trúc của enzym
(số chuỗi polipeptide) Khác nhau Giống nhau Khác nhau 7.1.3. ứng dụng
- Trong kỹ thuật tái tổ hợp ADN. - Lập bản đồ giới hạn.
- Phân tích so sánh bộ gen ở các loài khác nhau thông qua kỹ thuật RFLP.
7.2. Các nhóm enzym khác
ạ Các polimerase
Các polimerase tham gia vào quá trình tái bản ADN và phiên mã tổng hợp ARN và đ−ợc sử dụng nhiều trong kỹ thuật di truyền.
Các polimeasase gồm 2 nhóm :
(1) ADN – polimerase xúc tác tổng hợp chuỗi polinucleotit theo chiều từ 5’ đến 3’. Taq polimerase (enzyme tách từ vi khuẩn suối n−ớc nóng) có khả năng chịu nhiệt, sử dụng trong phản ứng chuỗi PCR. Enzym phiên mã ng−ợc (Reverse Transcriptase: RT – ase) xúc tác tổng hợp cADN từ khuôn ARN;
(2) Các ARN – polimerase tham gia tổng hợp ARN. Ngoài các enzym trên còn có nhiều enzym tham gia sửa chữa những sai sọt trên phân tử ADN.
Các loại enzym polimerase th−ờng dùng là: - Taq polimerase - ADN – polimerase I - Enzym phiên mã ng−ợc - T4 ADN-polimerase - Terminal transferase …
b. Enzym nối ADN – ligase
Enzym nối ADN - ligase xúc tác sự hình thành liên kết nối hai đoạn ADN và ARN. ADN – ligase là một enzym nối quan trọng trong tế bào vì chức năng của nó là sửa
chữa các mối liên kết photphodiester bị đứt gãy một cách ngẫu nhiên hoặc trong tái bản ADN hay tái tổ hợp ADN. ADN – ligase đ−ợc sử dụng trong kĩ thuật tạo dòng.
Một số enzym thuộc nhóm nàyđ−ợc sử dụng nhiều là: - Ẹ coli ADN – ligase
Enzym Ẹcoli ADN – ligase đ−ợc tách chiết từ Ẹ coli, xúc tác cho các phản ứng nối hai trình tự ADN có đầu dính.
- T4 ADN – ligase
Enzym này đ−ợc chiết từ phage T4 kí sinh ở Ẹ coli, xúc tác cho phản ứng nối hai trình tự có đầu bằng, đ−ợc sử dụng nhiều trong kĩ thuật tạo dòng.
- T4 ARN – ligase
Enzym T4 ARN – ligase chiết từ phage T4 kí sinh ở Ẹ coli, xúc tác cho phản ứng nối hai trình tự ARN bằng liên kết phosphodiester.
c. Enzym Nuclease
Enzym nuclease là nhóm enzym phân cắt ADN (ADNase) và ARN (ARNase).
- DN – ase I: enzym này có khả năng liên kết ngay sau một base pirimidine trên ADN mạch đơn hay mạch kép. Trong thực nghiệm DN – ase I đ−ợc sử dụng để loại ADN trong chế phẩm ARN và protein, tạo điểm đứt trong kĩ thuật đánh dấu mẫu dò.
- Nuclease S1: enzym này tách chiết từ Aspergillus oryzae có tác dụng phân giải ADN mạch đơn, mạch kép. Enzym nay đ−ợc sử dụng phân tích đặc điểm cấu trúc phân tử lai ADN – ARN, loại bỏ đầu so le để tạo đầu bằng, loại bỏ các nút vòng trên ARN trong phản ứng phiên mã ng−ợc tạo cADN.
- Exonuclease III: đ−ợc chết từ Ẹ coli xúc tác phản ứng phân giải tuần tự các nucleotit từ đầu 3’ – OH tự do của ADN theo chiều từ 3’ 5’ tạo ra những vùng mạch đơn trên ADN mạch kép.
- RN – ase A: enzym này có hoạt tính rất mạnh, có thể chịu đựng đ−ợc nhiệt độ 90P
0
P
c trong 60 phút. Enzym này có khả năng cắt liên kết photphodiester ngay sau một base pỉimidinẹ
- RN – ase H: enzym này có khả năng loại bỏ ARN trong phân tử lai ARN – ADN và th−ờng đ−ợc sử dụng để loại ARN sau phản ứng phiên mã ng−ợc để tiếp tục tổng hợp mạch thứ 2 của cADN tạo ADN mạch kép.
Ch−ơng III: công nghệ sinh học