IV. SỰ PHÂN LOẠI SINH GIỚ
3.Nuôi cấy mô tế bào thực vật và dung hợp tế bào trần
3.1. Lịch sử nuôi cấy mô, tế bào thực vật
- Giai đoạn một: Từ năm 1932 với công trình của White và Robins. Hai nhà khoa học này đã nghiên cứu khả năng sinh tr−ởng của các đoạn rễ cây đậu non và thấp tất cả các loại rễ đều cần thianin (b1) rễ cây đậu cần niaxin(C) rễ cà chua cần Feredoxin(B6)
- Giai đoạn hai: Từ năm 1937 cùng với Nobescuort Gauthret đã thành công trong việc duy trì sự sinh tr−ởng rắn bằng thạch bằng cách cấy truyền đều đặn sáu tuần một lần. Và thấy rằng mô rễ cà rổt cần Auxin, còn rễ các loại cây khác thì không cần Auxin - Giai đoạn ba: Từ năm 1950 với các công trình của Steward và Skoog nghiên cứu tác dụng của n−ớc lên sinh tr−ởng của mô cà rốt và thuốc lá. Ng−ời ta phát hiện ra là ADN tách từ tinh trùng cá thu có thể thay n−ớc dừa trong môi tr−ờng nuôi mô thực vật.
- Năm 1954 Shoog đã phát hiện Kinetin (6 furfurryl aminopurine) là chất điều kiện phân bào và phân hóa chồi .
- Thành công quan trọng của thời kì này là đã xây dựng và sử dụng có kết quả một số loại môi tr−ờngbán nhân tạo, đồng thời phát hiện đ−ợc vai trò của một số
vitamin đảm bảo sự thành công đối với việc nuôi cấy cơ quan (rễ) mô ở thực vật. Những thí nghiệm về môi tr−ờng dinh d−ỡng tính chất vật lí hóa học là những điều kiện quan trọng quy định thành công trong nuôi cấy mô.
- Giai đoạn hiện nay:
+ Là giai đoạn của những nghiên cứu về protoplast thực vật bắt đầu những công trình của Cooking (Anh-1960). Ông đã dùng men cellulase để phân hủy thành cellulose của tế bào thực vật và đã thu đ−ợc các tế bào trần (protoplast) khủe mạnh với đầy đủ chức năng sống, để có thể dùng cho các nghiên cứụ
+ Năm 1971, Takebe tái sinh đ−ợc cây thuốc lá hoàn chỉnh protoplast thuốc lá giống Santhi
ở Việt Nam hiện nay, nhiều cơ quan nghiên cứu nh−: Viện di truyền nông nghiệp, Đại học nông nghiệp I, Viện công nghệ sinh học … đã sử dụng các ph−ơng pháp nuôi cấy mô tế bà để nhân nhanh và làm thuần các giống ngô, chuối, cam quýt, khoai tây sạch bệnh…và ứng dụng ngay vào lĩnh vự sản xuất
3.3. những yêu cầu cơ bản của kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật
- Mẫu vật: Nói chung, gần nh− tất cả các phần của cây t−ơi đều có thể dùng làm mẫu để nuôi cấy mô nh− rễ, lá, thân, phấn hoa, noãn…Tùy theo mục đích nghiên cứu mà chọn mẫu t−ơng ứng. Tuy nhiên, nguyên tắc căn bản là mẫu cấy phải chứa các tế bào sống từ các mô non có các tế bào đang phân chia mạnh chiếm tỉ lệ lớn, nhất là dễ tạo mô sẹọ Cây gốc phải có phẩm chất tốt, năng suất cao, không có dấu hiệu bệnh, không ở trạng thái ngủ nghỉ.
- Phòng thí nghiệm, cần đ−ợc bố trí theo sơ đồ sau: buồng chuẩn bị, buồng cấy, buồng nuôi cấy (có giá nuôi cấy).
- Một số thiết bị nuôi cấy: bình nuôi cấy, nút đậy, ph−ơng tiện và hoá chất khử trùng
- thành phần môi tr−ờng dinh d−ỡng: hầu hết các loại môi tr−ờng bao gồm các chất chính sau đây:
+ Các loại muối khoáng + nguồn cacbon
+ Vitamin
+ Các chất điều khiển sinh tr−ởng + Các nhóm chất bổ sung
+ Chất độn
3.4. các công đoạn của nuôi cấy mô
- Chọn lọc những thứ, giống (kiểu di truyền) và những phần khác nhau của cây để giải quyết những nhiệm vụ đặt rạ
- Tiến hành nuôi cấy vô trùng
- Nghiên cứu các điều kiện đặc biệt (hỗn hợp dinh d−ỡng, nhiệt độ, chiếu sáng, độ ẩm không khí...) để kích thích mạnh quá trình phát triển(sử dụng vào chọn giống và sản xuất giống).
- Tái sinh các cây có khả năng sống.
- Chuyển các cây đã đ−ợc chọn lọc ra đất hay ra n−ớc để tiếp tục chọn giống và sản xuất giống.
Những nhiệm vụ đ−ợc giải quyết bằng ph−ơng pháp này trong tạo giống có thể đ−ợc gộp thành ba phức hệ t−ơng tác chặt chẽ với nhau:
+ Mở rộng nền di truyền cho tạo giống bằng cách gây và thu nhận các dạng vật liệu mới
+ Bảo vệ và nhân các cây hay các dòng −u tú nhất
+ Nhân và bảo vệ những vật liệu sạch virus ở các cây trồng nông nghiệp
3.5. Dung hợp tế bào trần
-Thành tế bào thực vật chủ yêú gồm pectin, cellulose, hemicellulose nên ng−ời ta sử dụng hỗn hợp các enzyme phá hủy cellulose, hemicellulose phá hủy hemicelluse (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tế bào trần (protoplast) do không có thành cellulose nên có khả năng “dung hợp” với nhaụ Khi dung hợp hai loại tế bào trần với nhau th−ờng có ba nguồn gen tham giănhân, ti thể, lạp thể) đ−ợc kết hợp trong các sản phẩm dung hợp, chính vì thế có thể xảy ra các hiện t−ợng:
+ Chỉ dung hợp nguyên sinhchất + Chỉ có sử dụng hợp nhân
+ Dung hợp trọn vẹn cả nhân và tế bào con: Tr−ờng hợp này xảy ra pí tần số thấp, thừơng xảy ra dung hợp nhân còn tế bào con sau dung hợp một trang ngắn có sự chọn lọc đào thải, chỉ có tế bào con của một trong hai loài phát triển.
- Hiện nay ng−ời ta phân biệt đ−ợc ba ph−ơng pháp dung hợp:
+ph−ơng pháp keller và Melchers dùng pH cao và nồng độ CaP
2+
P
cao (pH=10,5) + ph−ơng pháp cooking dùng NaNOB3B 0,25M để kích thích dung hợp
+ ph−ơng pháp Ka và Grambory: dùng polietilenglycol(PEG 500-600 M.W)
c) Những −u điểm của công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật và dung hợp tế bào trần
VD : Nuôi cấy mô, tế bào thực vật invitro trong việc chọn tạo giống và nhân giống vô tính .
Tế bào nuôi cấy invitro có khả năng tạo biến dị lớn (10P
-5P P –10P -8 P ), nếu không hợp xử lí đột biến và sử lí stress thì tần số có thể tăng lên gấp m−ời lần. Vì thế có thể chọn đ−ợc cá thể đột biến nhanh hơn và có hiệu quả hơn so với ph−ơng pháp chọn giống thông th−ờng. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, có thể dễ dây tiến hành xử lí stress, tạo các dòng chống chịu với đièu kiện cực đoan của môi tr−ờng: nóng, lạnh, hạn, mặn …
Nuôi cáy invitro đ−ợc coi là ph−ơng pháp nhân giống vô tính hữu hiệu nhất. Bằng ph−ơng pháp này có thể tạo ra quần thể cây trồng đồng đều, giữ nguyên đặc tính của cây mẹ, có thể số nhân giống cao sớm cho hiệu quả kinh tế cao, không tốn diện tích nhân giống. Đặc biệt hữu hiệu đối với những cây khó nhân giống bằng lai hữu tính, hoăc những cây quý hiếm, có l−ợng giống ban đầu hạn chế nh−ng lại yêu cầu nhân nhanh.
3.6. Các ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào
3.6.1. Nhân giống vô tính quy mô lớn.
Vi nhân giống đã đ−ợc ứng dụng rộng rãi với quy mô lớn, thậm chí là sản xuất công nghiệp. Kiểu nhân giống này −u việt hơn so với nhân giống bằng hạt hoặc bằng cơ quan dinh d−ỡng nh− chồi hay một đoạn thân.
Vi nhân giống có thể thực hiện theo cách nhân nối tiếp liên tục các cụm chồi mọc từ mô sẹo để thu số l−ợng lớn cây giống con. Kiểu nhân dòng vô tính này đ−ợc áp dụng cho nhiều cây trồng nhiệt đới ở quy mô th−ơng mạị VD: nhân giống vô tính cây cọ dầu ở Malaysia: từ một cây cao sản giống gốc nhập từ châu Phi, trong một năm nhân ra hàng nghìn cây con có độ đồng đều cao, phẩm chất tốt. Nêu nhân giống bằng hạt sẽ phải chờ lâu mới có số l−ợng nhiều, các cây con không đồng đều, sẽ gặp khó khăn trong thu hoạch, chế biến công nghiệp.
Ngoài ra, chủ động mùa vụ mang lại lợi ích kinh tế đáng kể. VD: khoai tây ở miền Bắc n−ớc ta trồng vào mùa lạnh, một hộ gia đình có khi phải giữ hàng tạ, hàng tấn củ khoai giống cho vụ sau vào mùa nóng với điều kiện bảo quản khoa khăn và hao hụt đáng kể.
Nh−ợc điểm đáng l−u ý của giống nuôi cấy mô là có nhiều cây biến dị cần sớm loại bỏ. Do có nhiều −u điểm nên xu h−ớng chung là tiến tới tự động hóa sản xuất giống nuôi cấy mô trên quy mô lớn.
3.6.2. Củ khoai bi và hạt giống nhân tạọ
Một ph−ơng pháp vi nhân giống khác đã có ứng dụng th−ơng mại ở khoai tây là sản xuất củ bị Khi các chồi phụ nuôi cấy mô của khoai tây đ−ợc trồng trong điều kiện có xitokinin và axit gibberillic thích hợp, chúng sẽ ra nhiều củ nhỏ gọi là củ bị Các của bi này ratá thuận lợi cho việc bảo quản và cung cấp giống khoai tây
6.3.3. Sản xuất cây giống sạch mầm bệnh.
Nhiều cây trồng và cây cảnh th−ờng bị nhiễm các bệnh vi sinh vật nh− virú, nấm vi khuẩn….Chúng gây thiệt hại nặng có khi đến 90% sản phẩm thu hoạch.
Dùng ph−ơng pháp nuôi cấy mô có thể loại đ−ợc virus bằng 3 cách: - Qua nhiều dòng cấy truyền, dòng nào bị nhiễm virus thì loại bỏ.
- Xử lí nhiệt độ: tăng nhiệt độ lên cao để giảm hạơc loại bỏ sự sao chép của virus. Th−ờng xử lí mô nuôi cấy ở 30 - 37P
o
P
C trong 10 - 14 ngày hoặc 50-60P
o (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
P
C với thời gian 5- 10 phút để loại virus.
- Xử lí xanh malachite hoặc thiouracil: khi mẫu mô đặt trên môi tr−ờng có các chất này, sự sinh sản của virus giảm.
3. 6.4. Lập ngân hàng gen thực vật.
Nhờ những thành tựu của những năm 1980, nuôi cấy tế bào, mô và cơ quan đ−ợc ứng dụng vào bảo tồn nguồn gen trong phòng thí nghiệm. Cách giữ giống có hiệu quả hơn cả đối với tế bào nuôi cấy mô là bảo tồn lạnh. Vấn đề quan trọng trong l−u trữ giống là không để xuất hiện biến dị, phải kiểm tra th−ờng xuyên sức sống và tính ổn định của giống. Lập ngân hàng gen thực vật bằng TB nuôi cấy mô là một cách bảo vệ sự đa dạng sinh học của thực vật.