IV. SỰ PHÂN LOẠI SINH GIỚ
2. ph−ơng pháp tách chiết axit nucleic
Mọi nghiên cứu và ứng dụng dinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một l−ợng axit Nu đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết axit Nu là thu nhận đ−ợc các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzym nội bào giải phóng ra môi tr−ờng khi tế bào bị phá vỡ).
2.1. Ph−ơng pháp tách chiết DNẠ
DNA là phân tử có kích th−ớc lớn, do đó trong thao tác cần tránh mọi tác nhân cơ học hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt, gãy phân tử nàỵ
Ph−ơng pháp tách chiết cơ bản gồm 3 b−ớc:
2.1.1. B−ớc 1: Phá màng TB và màng nhân (Tế bào Eukaryota).
Thông th−ờng ng−ời ta nghiên tế bào, mô trong một hỗn hợp các chất tẩy (detergent nh− SDS, sarcosyl) và proteinase (proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi tr−ờng, đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNẠ
2.1.2. B−ớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các
protein.
Mẫu đ−ợc lắc thật mạnh trong một dung dịch phenol và chloroform, dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan axit Nụ Protein bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha n−ớc có chứa axit Nu và sau khi li tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha n−ớc và pha phenol : chloroform. Pha n−ớc có chứa axit Nu sẽ đ−ợc thu nhận lạị
2.1.3. B−ớc 3: Tủa axit Nucleic. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận axit nucleic
d−ới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzym, mặt khác để có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Có 2 cách tủa thông dụng đó là:
* Tủa trong ethanol (ethylic alcohol), việc tủa này đ−ợc thực hiện trong môi tr−ờng có lực ion cao (nồng độ muối cao) và nồng độ ethanol cao (2,5 dung tích ethanol/ 1 dung tích mẫu), nhiệt độ thấp tạo điều kiện thuận lợi cho việc tủạ Hầu nh− toàn bộ axit nucleic đều tủa trong các điều kiện nêu trên.
* Tủa trong isopropanol, điểm khác biệt so với ph−ơng pháp trên là không cần sự hiện diện của muối, thể tích isopropanol/ thể tích mẫu là 1/1. Các DNA có trọng l−ợng phân tử thấp không bị tủa, do đó có thể loại chúng ra khi dùng cáhc tủa trong isopropanol.
Trong cả hai ph−ơng pháp, axit nucleic sẽ đ−ợc thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, căn tủa phải đ−ợc rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫụ
2.2. Ph−ơng pháp tách chiết RNA toàn phần.
Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzym là các ribonuclease (Rnase). Hơn nữa các RNnase lại có mặt ở khắp nơi (có rất nhiều trên đầu ngón tay của ng−ời thao tác...), có hoạt tính rất cao và rất bền vững với các tác nhân th−ờng dùng để loại bỏ enzym (việc xử lý nhiệt ở 90P
o
P
C trong 1 giờ không làm mất họat tính RNase). Vì những lí do đó, việc tách chiết RNA đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm bởi các RNase từ môi tr−ờng: thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ, hóa chất đều đ−ợc khử trùng bằng nhiệt hay hóa chất, tránh mọi tiếp xúc với dụng cụ bằng tay trần...
Ph−ơng pháp tách chiết RNA toàn phần cũng bao gồm các b−ớc cơ bản nh− đối với DNA:
* Tế bào, mô đ−ợc nghiền trong một dung dịch gồm một chất tẩy mạnh (SDS, sarcosyl) ở nồng độ cao, một tác nhân gây biến tính protein mạnh (guanidinium thiocyanate), một chât khử (2 mercaptoethanol). Hai loại chất sau có tác dụng ức chế hoạt động của các RNase nội bào và tách các protein liên kết khỏi phân tử RNẠ
* Các protein đ−ợc loại bỏ khỏi mẫu qua xử lí phenol:chloroform và li tâm.
* RNA hòa tan trong pha n−ớc đ−ợc tủa bằng ethnol và đ−ợc thu nhận lại qua li tâm. RNA có thể đ−ợc bảo quản trên 1 năm d−ới dạng tủa trong dung dịch ethanol hoặc đông lạnh ở -70P
o
P
C trong n−ớc có chứa Rnasine (một chất ức chế RNase).