ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM MỤC TIÊU
3.7.2. Phương pháp tách Caroten bằng sắc kí Cột cĩ qua giai đoạn xà phịng hĩa (ứng dụng khi định lượng Caroten trong sản xuất chất béo)
(ứng dụng khi định lượng Caroten trong sản xuất chất béo)
a. Nguyên lý: Xà phịng hĩa nguyên liệu bằng dung dịch KOH 2N trong cồn. Chiếtβ caroten trong phần xà phịng hĩa với ete dầu hỏa. Tiến hành sắc kí trên cột nhơm oxyt để các loại sắc tố khác phản ứng hấp thụ và do màu dung dịch β caroten ở quang phổ sắc kế.
b. Dụng cụ, vật liệu và thuốc thử
- Cối chày sứ họăc thủy tinh
- Dụng cụ cĩ lắp ống sinh hàn thu hồi - Bình lắng gạn
- Dụng cụ hút chân khơng - Phễu xốp
- Quang sắc kế
- Ete thường khơng chứa peoxyt - Ete dầu hỏa vừa cất lại
- Hỗn hợp ete dầu hỏa + ete (3 : 1) - Dung dịch KOH 30%
- Dụng cụ tách Caroten
- Dung dịch KOH 2N trong cồn 1 lít dung dịch chứa 112,3gam KOH - Dung dịch phenolphetalein 1% trong cồn
- Khí nitơ đĩng trong bình áp suất - Na2SO4 khan
- Cát sạch
- Nhơm Oxyt dùng cho sắc kí
c. Tiến hành thử
Cân chính xác khoảng từ 1- 50 g chất thử đã được thái nhỏ. Tùy theo hàm lượng β
Caroten nhiều hay ít, nghiền nát trong cát sạch trong cối chày sứ xà phịng hĩa với 1 lượng thích hợp KOH 2N trong cồn, đun cách thủy sơi trong bình cầu của máy cất với ống sinh hàn hồi lưu trong khí quyển khí nitơ thời gian từ 15 – 60 phút thường là 30 phút.
Dung dịch cịn đang sơi trong bình cầu, cho thêm nước cất vào rồi chuyển qua bình lắng gạn, thêm nước cất sao cho lượng nước gấp 2 – 3 lần lượng dung dịch KOH đã dùng, để sự phân chia được rõ ràng.
Cho vào 50ml ete khơng cĩ peoxyt lắc đều caroten tan vào ete, gạn lấy lớp ete nhiều lần như trên cho đến khi ete khơng cịn màu vàng nữa. Tập trung tất cả ete vào bình lắng gạn thứ 2. Rửa ete bằng nước cất đến khi hết kiềm với chỉ thị màu phenol phetalein.
Lọc ete qua 1 lớp Na2SO4 khan đựng trong phễu xốp bằng cách hút chân khơng. Rửa lớp Na2SO4 3 lần với ete.
Tập trung hết ete vào trong 1 bình cầu và cất ete ở nồi cách thủy 600C. Trong khí quyển khí nitơ phần ete cuối cùng để bay hơi tự nhiên khơng gia nhiệt phần cịn lại trong bình cầu hịa tan trong khoảng 5 ml ete dầu hỏa vừa cất lại để lên cột sắc kí đã chuẩn bị sẵng.
Dùng nhơm oxyt loại tiêu chuẩn.
Với lượng Caroten ít dùng ống thủy tinh nhỏ đường kính 7- 8 mm vừa cho nhơm oxyt vào vừa vỗ nhẹ vào ống để cho nhơm oxyt chặt và đều cao đến 16 – 18 cm.
Với lượng Caroten nhiều hơn dùng ống thủy tinh 25mm và cột thủy tinh 18-20 cm
Sau khi cho nhơm oxyt vào đều và chặt, đổ ete dầu hỏa lên trên và hút nhẹ chân khơng cho đến khi ete dầu hỏa thấm ướt đều cột sắc kí chảy xuống phía dưới cịn lai 1 ít ở trên.
Trong bình cầu nhiều lần với ete dầu hỏa đổ hết lên cột sắc kí. Khi ete dầu hỏa chảy hết qua cột, nghĩa là Caroten bị hấp thụ hết thay bình hứng vào bắt đầu hấp thụ bằng hỗn hợp ete dầu hỏa + ete, Lượng dùng tùy thuộc hàm lượng Caroten trong thực phẩm.
Khi hỗn hợp ete dầu hỏa + ete đã hịa tan hết caroten và chảy hết xuống bình hứng ra và sau khi để lại nhiệt nhiệt độ bình thường trong phịng đo và ghi thể tích thu được. Đo độ tắc quang học dung dịch caroten ở quang sắc kế, kính lọc S47 bước sĩng 465 nm cốc so màu thủy tinh dày 10ml. Cốc so màu thủy tinh đối chiếu đựng đầy ete dầu hỏa hoặc nước. Nếu dung dịch caroten sẩm màu quá. Cĩ thể pha lỗng với ete dầu hỏa để đo độ tắc quang học cho chính xác. Cần tính tỉ lệ pha lỗng để tính kết quả .
So sánh độ tắc quang học đọc được với biểu đồ mẫu vẽ từ thang mẫu chuẩn bị với β- caroten tinh khiết.
Chú ý: Trong chẩn độ caroten, tốt nhất là các dụng cụ thủy tinh dem sử dụng đều làm
bằng thủy tinh màu để tránh ánh sáng làm ảnh hưởng đến caroten.