R- CHNH2-COO H+ OCH2 CHN=CH 2-COOH
2.2.15. Xác định gluxit trong thực phẩm
a. Định nghĩa
Gluxit là những hợp chất hữu cơ, trong phân tử cĩ C, H,O kết hợp với nhau, trong đĩ cĩ nhiều nhĩm hyđroxyt và một nhĩm anđehyt hay xeton kết hợp với các nhĩm chức khác.VD: Saccaroza, tinh bột.
Về phương diện hố học, gluxit cĩ thể chia làm hai nhĩm:
Nhĩm oza gồm các loại nhĩm đường trực tiếp khử oxy, do cĩ nhĩm andehyt hay xeton tự do trong phân tử.Ví dụ: Glucoza, fructoza, latoza.
Nhĩm ozit, khơng trực tiếp khử oxy, vì các nhĩm andehyt và axeton ở dưới dạng kết hợp với nhĩm chức khác, khi thuỷ phân cho hai hoặc nhiều oza (các holozơ) VD: tinh bột, saccaroza…hoặc khi thuỷ phân, ngồi các oza cịn cho các chất khơng phải oza (các heterozit) VD: glucozit. Những gluzit khơng cĩ giá trị dinh dưỡng, mà những chất cĩ tính chất được ứng dụng làm thuốc chữa bệnh hoặc là các chất độc.
Về phương diện thực phẩm, gluxit là những oza và holozit cĩ giá trị sinh năng lượng, 1gam cho 4,1Calo.
b. Chuẩn bị mẫu thử
Các phương pháp định lượng gluxit bằng hố học đều dựa vào tính chất khử oxy của nhĩm andehyt hay nhĩm axeton tự do trong phân tử gluxit. Do đĩ chỉ định lựong được các oza. Muốn định lượng được Holozit phải thuỷ phân các chất này thành các oza đơn giản. Các chất khác như protit, lipit…đều ảnh hưởng đến định lượng gluxit, cần phải được thử trước khi chuẩn độ gluxit. Do đĩ trong chuẩn bị mẫu thử cĩ hai khâu kỹ thuật quan trọng cần chú ý là:
+ Cách thuỷ phân + Cách khử tạp chất
- Cách thuỷ phân
Thơng thường người ta dùng axit để thuỷ phân các đường bột khơng trực tiếp khử oxy thành đường trực tiếp khử oxy. Những axit mạnh ảnh hưởng tới rõ rệt đến một số loại đường nhất là ở nhiệt độ cao.
Ví dụ: Leluoza và phá huỷ đường này thành những dẫn xuất của furfurol. Do đĩ trong phương pháp thuỷ phân, cần xác định nồng độ axit, nhiệt độ, thời gian tối ưu để thuỷ phân vừa đủ các loại đường bột, khơng trực tiếp khử oxy thành các đường trực tiếp khử oxy, định lượng được bằng các phương pháp hố học, lý học và hố lý.
Những điều kiện qui định cho phương pháp thuỷ phân:
- Dung dịch đường bột phải pha lỗng, cĩ nồng độ từ 4-10% tính bằng đường glucoza. - Mơi trường thuỷ phân là mơi trường HCl 1N, thơng thường pha: Dung dịch đường bột 4 -10% là 50 ml và 5 ml HCl tinh khiết (d =1,19)
- Nhiệt độ và thời gian tuỳ theo từng loại đường như sau:
+ Thuỷ phân đường saccaroza ở nồi cách thuỷ nhiệt độ 40-750C. Dùng đúng 2 phút để nâng nhiệt độ lên đến 68-750C. Giữ ở nhiệt độ này đúng 5 phút.
+ Thuỷ phân đường lactoza ở nồi cách thuỷ sơi trong 30 phút. + Thuỷ phân tinh bột, dextrin ở nồi cách thuỷ sơi trong 3 giờ. - Sau khi thuỷ phân cần làm lạnh ngay dưới vịi nước chảy.
- Trung hồ lại bằng NaOH 30% (hoặc KOH 30%), sau bằng NaOH 1N, rồi NaOH 0,1N (hoặc KOH 1N và KOH 0,1N) với phenolphetalein làm chỉ thị màu.
Nếu định lượng bằng phương pháp Bectrăng hay phương pháp Feling, cĩ thể dùng dịch chiết hơi kiềm, vì các phương pháp này định lượng đường ở mơi trường kiềm.
- Khử tạp chất và định lượng bằng các phương pháp khác nhau.
Khử tạp chất: Cĩ thể khử tạp chất bằng các phương pháp sau đây:
- Khử tạp chất bằng kẽm feroxyanua.
+ Dung dịch khử tạp chất gồm
- Dung dịch Kalferoxyanua 15%: Cân 15g Kaliferoxyanua thêm nước cất vừa đủ 100ml. - Dung dịch Kẽm axetat 30%: Cân 30g Kẽm axetat thêm nước cất vừa đủ 100ml.
+ Dịch thử đã thuỷ phân và trung hồ được cho vào bình định mức dung tích 100ml, nước cất rửa cũng dồn cả vào bình định mức. Cho vào 5 ml dung dịch Kaliferoxyanua 15%, lắc đều, để yên 2-3 phút. Cho thêm 5 ml kẽm axetat 30%, lắc mạnh, cho thêm nước cất vừa đủ 100ml, lắc đều và lọc qua giấy lọc gấp khơ. Dịch lọc dùng để định lượng bằng các phương pháp hố học, lý học và hố lý.
- Khử tạp chất bằng dung dịch Pb(CH3COO)2 30%.
Dịch thử đã thuỷ phân và trung hồ, được cho vào bình định mức dung tích 100ml,cùng với nước rửa, dùng ống đo đổ vào 7ml dung dịch chì axetat 30%, lắc và để yên 5 phút, nếu thấy xuất hiện một lớp chất lỏng trong suốt ở bên trên lớp cặn thì việc khử tạp chất đã xong.
Cho vào 18-20 ml dung dịch bão hồ đinatriphotphat hay natri sunfat để loại chì axetat thừa. lắc đều và để kết tủa lắng xuống. Nếu cĩ kết tủa do đinatriphotphat tác dụng với chì axetat thừa thì nên để yên 10 phút. Cịn với natri sunfat nếu lớp nước bên trên bị đục thì để lâu 24h. Kiểm tra lại xem đã kết tủa hết chì axetat thừa chưa, bằng cách cho hết sức cẩn thận một vài giọt đinatriphotphat hay natri sunphat vào thành bình.
Nếu khơng thấy vẩn đục các chất lỏng tiếp xúc với nhau thì coi như đã hết chì axetat. Thêm nước cất vừa đủ 100ml, lắc đều và lọc qua giấy lọc gấp, khơ. Dịch lọc dùng để định lượng bằng các phương pháp hố học, hố lý và lý học.
- Khử tạp chất bằng dung dịch patanh (patein):
+ Dung dịch patanh: Cân 220g chì oxyt đỏ vào chén sứ nghiền nát, cho thêm 160ml HNO3 đậm đặc, khuấy đều 5-6 phút, cho 160ml nước cất, đun sơi để hồ tan. Để nguội, cho 10ml NaOH, rồi cho nước cất vừa đủ 1000ml.lắc đều và lọc.
+ Dịch thử đã thuỷ phân và trung hồ được cho vào bình định mức dung tích 100ml,với nước rửa, cho thêm 5ml dung dịch patanh lắc đều, để yên trong 10 phút và lọc. Dịch lọc dùng để định lượng bằng các phương pháp hố học, lý học và hố lý.
Khử tạp chất bằng dung dịch Kali iodomereurdt:
+ Dung dịch Kali iodomereurdt:
Cân 13,5g HgCl2 vào 320ml nước cất nĩng. Cân 33,2g KI vào 320ml nước cất. Trộn hai dung dịch với nhau, để nguội và cho thêm 200ml axit axetit.
+ Dung dịch axit photphotungstic 6%.
+ Dịch thử đã thuỷ phân và trung hồ, được cho vào bình định mức dung tích 100ml,với nước rửa. cho thêm 20 ml dung dịch Kali iodomereurat và 10ml dung dịch axit
photphotungstic. Lắc đều. Cho nước cất vừa đủ 100ml, lắc đều để yên 10 phút và lọc. Dịch lọc dùng để định lượng bằng các phương pháp hố học, hố lý và lý học.
- Khử tạp chất bằng nhĩm Hydroxyt:
+ Hỗn hợp dung dịch nhơm hydroxyt: Dung dịch nhơm clorua 1% (hoặc nhơm sunfat 1%) và NH4OH vừa đủ để kết tủa. Để lắng và rửa với nước cất cho đến khi khơng cịn phản ứng Cl- (hoặc SO42-) giữ dưới một lớp nước cất, với thời gian khơng được đĩng vĩn thành cục:
AlCl3 + 3NH4OH → Al(OH)3 + 3NH4Cl
+ Dịch thử đã thuỷ phân và trung hồ, được cho vào bình định mức dung tích 100ml, với nước rửa cho thêm 3-5ml dung dịch Al(OH)3, lắc đều. Cho thêm nước cất vừa đủ 100ml, lắc đều để yên 10 phút và lọc. Dịch lọc dùng để định lượng bằng các phương pháp hố học, hố lý và lý học.
+ Chú ý:
- Tuỳ theo từng trừơng hợp và tuỳ theo điều kiện thực tế của từng phịng thí nghiệm, cĩ thể dùng một trong các thuốc thử tạp chất trên và cũng tuỳ theo từng trường hợp, cĩ thể thuỷ phân trước và khử tạp chất sau.VD:Trường hợp tinh bột, hoặc khử tạp chất trước và thuỷ phân sau. Trường hợp các thực phẩm cĩ gluxit hồ tan và nhiều protit, lipit.
c. Các phương pháp kiểm nghiệm một loại đường
-Trường hợp thực phẩm chứa một loại đường khử, dùng một trong nhưng phương pháp sau đây để định lượng. Nếu thực phẩm chứa một loại ozit ( tinh bột , dextrin hoặc Saccaroza ) thì thuỷ phân và định lượng một trong những phương pháp sau. Kết quả theo bảng, hoặc cĩ thể sử dụng các hệ số sau đây :
Lượng tinh bột bằng lượng glucaza x 0,9 Lượng Saccaroza = Lượng glucoza x 0,95
Trường hợp thực phẩm chứa nhiều loại oza hoặc ozit, phải áp dụng cho các phương pháp định lượng các loại đường cùng cĩ trong một loại thực phẩm ( phần sau )
d. Phương pháp Bectrang (BERTRANH)
+ Nguyên lý
- Gluxit trực tiếp khử oxi cĩ tính chất khử Cu(OH)2 ở mơi trường kiềm mạnh làm cho nĩ kết tủa dưới dạng Cu2O màu đỏ gạch. Số lượng Cu2O tương ứng với lượng gluxit khử oxi. RCHO + 2Cu(OH)2 → RCOOH + Cu2O + 2H2O
Cu2O cĩ tính chất khử oxi tác dụng với muối Fe3+ làm cho muối này chuyển thành muối Fe2+ ở mơi trường axit.
Cu2O + Fe2 (SO4)3 + H2SO4 → 2CuSO4 + H2O + 2FeSO4
FeSO4 cĩ tinh chất khử oxi, cĩ tác dụng với KMnO4 là chất oxi hố do đĩ dùng KMnO4 để chuẩn độ FeSO4 ở mơi trường axit
10FeSO4 + 8H2SO4 + 2KMnO4 → K2SO4 + 2MnSO4 + 5Fe2(SO4)3 + 8H2O
Từ số ml KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ FeSO4 sinh thành. Tra bảng để cĩ số mg đường glucoza, matoza, lactoza hoặc saccroza nhân với hệ số pha lỗng, ta cĩ hàm lượng đường trong 100 gam thực phẩm.
+ Dụng cụ, vật liệu và thuốc thử
- Dụng cụ, vật liệu thơng thường của phịng thí nghiệm - Phễu lọc thuỷ tinh.
- Nồi cách thuỷ - Nhiệt kế 1000C
- Dung dịch NaOH 20%, 10% và 1% - HCl đậm đặc (d = 1,19)
- Dung dịch khử tạp: Chì acetat hoặc kaliferroxyanua và kiềm acetat (xem phần khử tạp chất) - Thuốc thử feling gồm:
+ Thuốc thử feling A: Cân 69,28g CuSO4 tinh thể thêm nước cất vừa đủ 10ml ( lắc kỹ cho tan nếu khơng tan cho thêm axít sunfurie và lắc kỹ ).
+ Thuốc thử B: Cân 346gam KNaC4H4O6 (Kalinatritractrat) và 100gam NaOH thêm nước cất vừa đủ 1000ml ( hồ tan 346g KNaC4H4O6 trong 400 ÷ 500ml nước cất. Mặt khác hồ tan 100g NaOH trong 200 ÷ 300ml nước cất trộn hai dung dịch với nhau và thêm nước cất vừa đủ 1000ml).
Khi dùng lấy 10ml dung dịch feling A pha với 10ml dung dịch feling B. - Dung dịch Fe2(SO4)3:
Cân 50 gam Fe2(SO4)3 trong một lượng nước vừa đủ tan, thêm vào từ từ vừa cho vừa lắc đều, 200 gam H2SO4 đậm đặc để nguội và thêm nước cất vừa đủ 1000ml.
Dung dịch này khơng được chứa Fe(OH)2 hoặc muối sắt II do đĩ cần oxi hố Fe(II) bằng cách nhỏ dung dịch KMnO40,1N vào cho đến khi cĩ màu phớt hồng.
- Dung dịch kalipecmanganat (KMnO4) 0,1N - Dung dịch phelnolphetalein 1% trong cồn 900
+ Tiến hành thử - Chuẩn bị mẫu thử:
Cân một lượng chất thử, tính sao cho phần lọc để chuẩn độ sẽ cĩ nồng độ đường (biểu thị bằng glucozơ ) vào khoảng 4÷5%
Cho lượng chất thử vào một bình định mức dung tích 500ml, tráng lại dung cụ đã đựng chất thử vài lần với nước cất. Nước cất cho cả vào bình khơng được vượt quá 250ml trung hồ axít hữu cơ cĩ trong chất thử bằng dung dịch NaOH 10% đến pH = 7 (kiểm tra bằng giấy pH vạn năng).
- Nếu định lượng các loại đường hồ tan thì chiết xuất đường bằng nước cất như sau: Đun cách thuỷ ở 800C trong 15 phút, thỉnh thoảng lắc đều khi đun, để nguội đến nhiêt độ phịng, khử tạp chất (như đã hướng dẫn ở phần khử tạp chất ) cuối cùng cho nước cất vừa đủ 500ml, lọc và chuẩn độ nếu là đường glucozơ hoặc đường trực tiếp khử oxy khác.
Nếu là đường saccaroza, tiến hành thuỷ phân bằng cách lấy 50ml dung dịch lọc trên cho vào bình định mức 100ml với 5ml HCl đậm đặc, đĩng nút bình cĩ sẵn một nhiệt kế đo đến 1000C đặt bình vào trong bình cách thuỷ (nước đã đun nĩng đến 750C ) sau hai phút dung dịch thuỷ phân trong bình phải đạt 680C giữ dung dịch ở nhiệt độ 68÷700C trong 5 phút làm lạnh nhanh chĩng dưới vịi nước lạnh trung hồ dung dịch trước bằng NaOH 20%, sau bằng NaOH 1% với
phenolphtalein làm chỉ thị màu, làm nguội đến nhiệt độ phịng và thêm nước cất vừa đủ 100ml. Dung dịch này dùng để chuẩn độ.
Nếu chất thử là tinh bột hoặc dexitrin khơng hồ tan trong nước thì phải tiến hành thuỷ phân trước và khử tạp chất sau. Sau khi trung hồ, tất cả khoảng 250ml, cho thêm 25ml HCl đậm đặc, chuyển tất cả vào bình cầu cĩ lắp ống sinh hàn hồi lưu,và đặt trực tiếp trên ngọn lửa đun sơi trong 3 giờ, làm lạnh nhanh chĩng dưới vịi nước chảy chuyển sang bình định mức với nước tráng bình cầu, khử tạp chất như đã hướng dẫn ở phần trên, cuối cùng thêm nước cất vừa đủ 500ml lọc và dịch lọc dùng để chuẩn độ.
+ Xác định hàm lượng đường:
Cho vào bình nĩn dung tích 250ml: 10ml dung dịch feling A và 10ml dung dịch feling B. Đun sơi cho 10ml dịch lọc đã chuẩn bị ở trên và khoảng 20ml nước cất. Sau 3 phút, tồn bộ dung dịch phải sơi. Để cho sơi đúng 2 phút kể từ khi bắt đầu sơi lại.
Lấy bình ra và để nghiêng cho cặn Cu2Olắng xuống. Dung dịch bên trên lớp cặn phải cĩ màu xanh của Cu(OH)2. Nếu dung dịch bên trên cĩ màu xanh lục, vàng hoặc nâu nghĩa là khơng đủ lượng đồng cần thiết, phải làm lại lấy một dịch lọc ít hơn, cuối cùng thêm nước cất cho cĩ tồn bộ khoảng 50ml.
Khi kết tủa Cu2O lắng xuống gạn lấy phần nước bên trên và lọc qua phễu lọc cắm xuyên qua nút cao su của bình lọc cĩ nhánh nối liền với ống hút chân khơng bằng tia nước (như hình vẽ) Cho nước đun sơi vào bình nĩn và tiếp tục gạn lọc vào phễu cho đến khi nước trong bình nĩn hết màu xanh, trong quá trình gạn lọc tránh đừng để cho kết tủa rơi vào phễu và luơn luơn giữ lớp nước đã đun sơi trên mặt kết tủa trong bình nĩn và trong phễu.
Lần gạn lọc cuối cùng, gạn hết nước và cho ngay vào bình nĩn 20ml dung dịch Fe2(SO4)3 để hồ tan kết tủa Cu2O. Rút hết nước trên phễu, ngừng cho chảy tia nước ở ống hút chân khơng, thay bình hút lọc cũ bằng bình mới, đổ dung dịch Fe2(SO4)3 đã hồ tan hết kết tủa Cu2O trong bình nĩ và rửa phễu bằng dung dịch Fe2(SO4)3 cho đến khi khơng cịn vết Cu2O trong bình nĩn và trong phễu. Hút xuống bình lọc và tráng rửa lại bằng nước cất đun sơi, hút cả xuống bình lọc. Chú ý là chỉ dùng khoảng 30÷50ml Fe2(SO4) để hồ tan hồn tồn kết tủa Cu2O tráng bình và rửa phễu.
Lấy bình lọc ra và chuẩn độ dung dịch Fe2+ hình thành bằng dung dịch KMnO4 O,1N cho tới khi xuất hiện màu hồng nhạt bền vững trong 30 giây
Đọc số ml KMnO4 0,1N đã dùng và đem kiểm tra ở bảng 2.1, 2.2., 2.3.,để cĩ lượng đường glucoza, lactoza, maltoza hoặc đường nghịch chuyển tuỳ theo yêu cầu .
Bảng 2.1. Xác định lượng đường nghịch chuyển
Đường nghịch chuyển (mg) KMnO4 0,1N (ml) Đường nghịch chuyển (ml) KMnO4 0,1N (ml) Đường nghịch chuyển (ml) KMnO4 0,1N(ml) Đường nghịch chuyển (ml) KMnO4 0,1N (ml) 10 3,24 33 1,01 56 16,6 78 22,4 11 3,55 34 10,04 57 16,9 79 22,6 12 3,87 35 10,7 58 17,2 80 22,9 13 4,17 36 11,0 59 17,4 81 23,2 14 4,49 37 11,3 60 17,7 82 23,4 15 4,80 38 11,6 61 18,0 83 23,7 16 5,12 39 11,9 62 18,2 84 23,9
Đường nghịch chuyển (mg) KMnO4 0,1N (ml) Đường nghịch chuyển (ml) KMnO4 0,1N (ml) Đường nghịch chuyển (ml) KMnO4 0,1N(ml) Đường nghịch chuyển (ml) KMnO4 0,1N (ml) 17 5,43 40 12,2 63 18,5 85 24,1 18 5,73 41 12,5 64 18,8 86 24,3 19 6,05 42 12,7 65 19,0 87 24,6 20 6,36 43 13,0 66 19,3 88 24,8 21 6.67 44 13,3 67 19,5 89 25.1 22 6,96 45 13,96 68 19,8 90 25.3 23 7,27 46 13,9 69 20,1 91 25,6 24 7,57 47 14,1 70 20,3 92 25,9 25 7,84 48 14,4 71 20,5 93 26,1 26 8,14 49 15,0 72 20,8 94 26,3 27 8,45 50 15,0 73 21,1 95 26,6 28 8,74 51 15,52 74 21,3 96 26,8 29 9,03 52 15,85 75 21,6 97 27,0 30 9,33 53 15,8 76 21,8 98 27,3 31 9,64 54 16,1 77 21,8 99 27,5 32 9,94 55 16,4 78 21,1 100 27,8
Bảng 2.2. Xác định lượng đường lactoza Lactoza (mg) Dung dịch KMnO4 0,1N (ml) Lactoza (mg) Dung dịch KMnO4 0,1N (ml) Lactoza (mg) Dung dịchKMnO4 0,1N(ml) Lacto za (mg) Dung dịch KMnO4 0,1N (ml) 10 2.26 39 8.55 68 14.4 97 20.1 11 2.48 40 8.73 69 14.6 98 20.3 12 2.70 41 8.94 70 14.8 99 20.6 13 2.92 42 9.14 71 15.0 100 20.7 14 3.13 43 9.35 72 15.2 15 3.36 44 9.54 73 15.4 16 3.49 45 9.74 74 15.6 17 3.80 46 9.98 75 15.8 18 4.02 47 10.1 76 16.1 19 4.23 48 10.3 77 16.3 20 4.47 49 10.5 78 16.4