2. 5 Xác định phốt phát (PO4 3-)
2.2.12. Xác định Protit trong thực phẩm
Định nghĩa: Về phương diện hĩa học, protit là những chất hữu cơ mà thành phần cấu tạo
gồm C, H, O, N và cĩ khi cịn cĩ P và S.
Protit bao gồm các axit amin và những hợp chất ( peptit, protein) khi bị thủy phân cho một hoặc nhiều axit amin. Peptit là do một số giới hạn axit amin kết hợp với nhau bởi dây nối peptit ( nhĩm chức của axit amin này kết hợp với nhĩm chức amin của axit amin kia ).
a. Xác định Protit thơ
Về nguyên tắc, protit thơ trong thực phẩm được định lượng bằng cách xác định lượng nitơ tồn phần và kết quả nhân với 6,25, như thế nghĩa là protit luơn luơn chứa 16% nitơ, thực tế, trong thực phẩm, bên cạnh protit thật, cĩ những chất hữu cơ khác cĩ chứa nitơ như amit, alcaloit, amoniac (VD: trong thức phẩm lên men), axit nitric…do đĩ hàm lượng nitơ tồn phần chính thức cao hơn 16%. Ở protit động vật, hàm lượng nitơ tồn phần cũng thường cao hơn 16% ( 16 ÷ 17% ), nhưng ở protit thực vật thì hàm lượng này thấp hơn 16%. Hệ thơng số 6,25 trung bình thơ, trong một vài trường hợp muốn cĩ kết quả chính xác, nên dùng những hệ số đặc biệt, như với:
Lúa mì và các chế phẩm 6,95
Sữa và các chế phẩm 6,38 Thực phẩm nguồn gốc động vật 6,25 Khoai tây, gạo và các chế phẩm 6,25
Thức ăn gia súc 6,25
Ngơ, đỗ tương, lúa mạch, lúa đại mạch 6,00
Đậu đỗ, khơ lạc 5,70
Khơ dầu bơng, khơ dầu lạnh 5,50
+ Xác định protit thơ theo phương pháp kendan (Kjedahl)
Phương pháp định lượng nitơ tồn phần đơn giản chính xác là phương pháp kendan.
- Nguyên lý
Vơ cơ hĩa thực phẩm bằng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác. Dùng một kiềm mạnh (NaOH hoặc KOH) đẩy NH3 từ muối (NH4)SO4 hình thành ra thể tự do. Định lượng NH3 bằng một axit.
- Dụng cụ, vật liệu và thuốc thử
- Bình kendan
- H2SO4 đậm đặc (d = 1,19)
- Chất xúc tác: Cĩ thể dùng một trong các hỗn hợp xúc tác sau đây: -
Hai loại xúc tác sau làm vơ cơ hĩa rất mạnh, nhúnh loại thứ 3, cho hơi Hg độc. NaOH 50% (d = 1,33) khơng chứa Cacbonat
- Chỉ thị màu cĩ thể dùng:
+ Alizarin natri sunfonat hoặc + Chỉ thị màu Tashiro gồm: Dung dịch A:
Hịa tan ở nồi cách thủy sơi: Dung dịch B:
Khi dùng, pha dung dịch A và dung dịch B theo tỷ lệ 1/1 thể tích. Hỗn hợp chỉ thị màu này cĩ màu xanh lục ở pH > 5,5 chuyển thành tím ở pH < 5,5 chuyển màu ở giai đoạn màu xám (pH = 5,5).
Trong trường hợp chuyển màu khơng rõ ràng, cĩ thể thay đổi tỷ lệ pha chế giữa hai dung dịch làm sao khi chuyển màu thì màu xanh lục giảm từ từ và một giọt dung dịch chuẩn NaOH 0,1N làm màu chuyển sang xám đột ngột và thêm một giọt nữa màu chuyển sang tím.
Dung dịch axit Borit bão hịa ở pH= 5,5: Cân 40g axit Borit thêm nước cất vừa đủ 1000ml.
Hịa tan 40gam axit Borit bằng một ít nước nĩng sau khi để nguội thêm nước cất vừa đủ 1000ml. Điều chỉnh đến pH = 5,5 bằng NaOH 0,1N (khoảng 13ml) với hỗn hợp chỉ thị màu TASHIRO cho đến màu xám.
Dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N và HCl 0,1N.
Natri hyposunfit tinh khiết (Na2S2O3) hoặc Natri hypophotphit (NaH2PO2).
+ Tiến hành thử
Cân thật chính xác khoảng 1gam thực phẩm. Cho vào bình Kendan với 10ml H2SO4 đậm đặc và khoảng 5gam chất xúc tác. Để nghiêng bình Kendan trên bếp và đun từ từ. Nếu thực phẩm chứa nhiều nước, đun cho đến khi nước bốc hơi và hình thành khĩi trắng SO3; khi bọt tan đun đến khi dung dịch trong suốt khơng màu hoặc cĩ màu xanh lơ của CuSO4. Để nguội chuyển vào bình kenđan A , trung hồ bằng NaOH 50% với alyzazin natrisunfonat làm chỉ thị màu ( hoặc với chỉ thị Tasharo ), Sau đĩ thêm 50ml NaOH 50% cất kéo hơi nước và định lượng trực tiếp bằng NH3 bay sang hồ tan trong bình hứng C, bằng dung dịch H2SO4 0,1N.
1 K2SO4 50g CuSO4 3,5g 2 K2SO4 100g CuSO4 10g Seleni bột 1g 10g 3 K2SO4 100g CuSO4 10g HgO 10g 10g Cồn 950 100ml Metyl đỏ 0,01g Cồn 950 vừa đủ 100ml
Sơ đồ hệ thống chưng cất Nước vào Nước ra —— + Tính kết quả: Nitơ tồn phần (g/100g) = 5 100 0014 , 0 G V× × Trong đĩ : V : Số ml H2SO40,1N dùng để chuẩn độ mẫu thử G5 : Trọng lượng mẫu thử tính bằng gam
Chú ý :
Cĩ thể chuẩn độ NH3 bay ra bằng phương pháp gián tiếp, trong trường hợp này để NH3 hồ tan vào thể tích H2SO4 0,1N thừa bằng NaOH 0,1N. Kết quả hàm lượng nitơ tồn phần theo phần trăm được tính theo cơng thức:
Nitơ tồn phần (g/100g) = 5 1 2 ) 100 ( 0014 , 0 G V V − × Trong đĩ :
V2 Số ml H2SO40,1N cho vào bình nĩn trước để kết hợp với NH3 V1 Số ml NaOH dùng để chuẩn độ thừa.
G5 Trọng lượng mẫu thử tính bằng gam
Muốn tính ra protit lấy kết quả nhân với 6,25 hoặc với các hệ số khác tuỳ theo từng trường hợp.
Trường hợp thực phẩm cĩ chứa nitrat phải tính nitrat riêng và nitơ tồn phần, trừ đi kết quả nitơnat, mới là kết quả nitơ hữu cơ. Hàm lượng protit bằng nitơ nhân với 6,25.
Trường hợp xúc tác cĩ chứa thuỷ ngân trước khi cất NH3 để định lượng cho vào 1 gam hypơphotphit hay natrihyposunfit để phá huỷ hợp chất hữu cơ hình thành.
b. Xác định protein
Phương pháp kenđan định lượng nitơ tồn phần nghĩa là nitơ của protit thơ ( gồm nitơ của protein, peptit, popeptit và nitơ của các chất phi protit).
Các phương pháp định lượng protein hồ tan gồm 3 phương pháp. + Các phương pháp thường.
+ Các phương pháp vi lượng.
Các phương pháp này dựa vào việc tách và kết tủa prơtein thật ra khỏi chất thử, rồi định lượng nitơ trong kết tủa theo phương pháp kenđan. Các phương pháp thường để xác định protein.
+ Phương pháp Stutez – Barnatein
- Nguyên lý:
Chiết protein bằng nước, kết tủa protein ở dịch chiết bằng CuSO4. Tách kết tủa rửa sạch và định lượng nitơ tồn phần trong kết tủa bằng phương pháp kenđan.
- Dụng cụ, vật liệu và thuốc thử
- Dung dịch CuSO4: Cân 60g CuSO4 thêm nước cất vừa đủ tới vạch 1000ml
- Dung dịch NaOH bảo hồ : Cân 12,5 g NaOH thêm nước cất định lượng tới vạch 1000ml.
- Dung dịch kalyferoxuyania : Cân 5g kaliferoxuyania thêm nước cất vừa đủ 100ml - Dung dịch BaCl2 : Cân 10g BaCl2 thêm nước cất vừa đủ đến 100ml.
+ Tiến hành thử
Cân thật chính xác khoảng 10gam chất thử đã nghiền nhuyễn, cho vào cốc thủy tinh với 50ml nước cất. Đun sơi.
Cho vào dịch chiết 25ml dung dịch CuSO4, sau đĩ vừa cho vừa khuấy vừa cho từ từ 25ml NaOH bảo hồ sau khi để kết tủa lắng xuống, nước ở phía trên phải cĩ phản ứng kiềm (thử với giấy quỳ) phải cĩ thừa Cu2+ ( phản ứng lên màu nâu với kaliferoxuyania ). Gạn bỏ lớp nước trên qua giấy lọc, Rửa kết tủa bằng nước cất và gạn bỏ lớp nước trên qua giấy lọc, khi nào nước lọc khơng cho phản ứng trung tính với kaliferoxuyania nữa (hết Cu2+), hoặc với BaCl2 (hết SO42-) đổ hết cả kết tủa lẫn nước lên giấy lọc. Để ráo nước cho kết tủa protein cùng với giấy lọc vào bình kenđan.
+ Xác định protein theo phương pháp dùng axit tricloaxetic ( Theo Green World) - Nguyên lý
Chiết protein bằng thực phẩm bằng nước. Kết tủa protein ở dịch chiết bằng axit tricloaxetic. Tách kết tủa rửa sạch và định lương nitơ tồn phần trong kết tủa bằng phương pháp kenđan.
+ Dụng cụ , vật liệu và thuốc thử
- Dụng cụ vật liệu thơng thường của phịng thí nghịêm. -Axitricloaxetic 10% & 20% .
+ Tiến hành thử:
Cân thật chính xác khoảng 10 gam chất đã nghiền nhuyễn, cho vào bình nĩn với nước cất vừa đủ 75ml. Sau khi để nguội cho vào dịch chiết khoản 25 ml tricloaxetic 10%, để thể tích tồn bộ chiết và axit tricloaxetic là 100ml. cĩ nồng độ axittricloaxetic là 2,5%. Để qua đêm và lọc giấy lọc và rửa qua kết tủa bằng axit tricloaxetic 2%. Để ráo kết tủa, cho kết tủa protein cùng với giấy lọc vào bình kenđan và tiến hành định lượng nitơ theo phương pháp kenđan.
+ Phương pháp sử dụng Natrisunfat bão hồ và cồn ở 780 ở mơi trường axit
+ Nguyên lý: Kết tủa protein bằng dung dịch Natrisunfat bão hồ và cồn ở 780 ở mơi
trường axit. Định lượng phần nitơ phi protein trong dịch lọc bằng phương pháp kenđan Nitơ protein = Nitơ tồn phần – Nitơ phi protein
+ Dụng cụ vật liệu và thuốc thử:
- Dụng cụ, vật liệu thơng thường của phịng thí nghiệm - HCl 0,53% & H2SO4 1,3%
- Cồn 950
- Dung dịch Na2SO4 bão hịa : Cân 78g Na2SO4.10H2O nước cất vừa đủ 100ml + Tiến hành thử:
Cân thật chính xác 5-10 gam chất thử đã nghiền nhuyễn, cho vào bình nĩn với 100 ml HCl 0,53% ( Hoặc H2SO4 1,3%) lắc đều. Để một thời gian, cho tiếp 95 ml cồn 950 vừa đủ 200ml, Để yên 3 giờ lọc qua giấy lọc khơ. Lấy một phần dịch lọc để định lượng nitơ phi protein theo phương pháp kenđan.
Nitơ protein hồ tan trong 100g chất thử sẽ là hiệu của nitơ tồn phần trong 100g chất thử trừ đi nitơ phi protein trong 100g chất thử.