ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM MỤC TIÊU
3.11.2. Phương pháp hĩa học
a. Nguyên lý
- Sau khi chiết vitamin B2 ở dạng kết hợp và tự do từ thực phẩm ra, loại bỏ huỳnh quang tạp bằng clorofoc tiến hành phản ứng quang hĩa dưới ngọn đèn 500W để chuyển riboflavinthanhf lumiflavin cĩ huỳnh quang. Chiết lumiflavin bằng clorofoc, đọc cường độ huỳnh quang ở huỳnh quang kế hoặc so sánh độ huỳnh quang với thang màu huỳnh quang dưới đèn tia cực tím.
b. Dụng cụ, vật liệu và thuốc thử
- Dụng cụ thơng thường của phịng thí nghiệm. - Đèn chiếu 500W cĩ lá chắn phản chiếu. - Máy ly tâm và ống ly tâm.
- Axit axetic đậm đặc. - HCl 0,1N; NaOH 7N. - Na2SO4 khan.
- CH3COONa 3,7N : Cân 303,4g CH3COONa nước cất vừa đủ 1000ml. - Kalipeemanganat 3%.
- H2O2 1,7%. - Clorofoc.
- Men.
- Dung dịch fluoresxen 1% trong nước.
- Dung dịch vitamin B2 tiêu chuẩn : Để khơ vitamin B2 trong bình hút ẩm cĩ H2SO4 đậm đặc để hút ẩm. Cân 25mg vitamin B2 cho vào một bình định mức màu nâu dung tích 1 lít. Cho thêm 700 ml nước cất và 1,5ml axit CH3COOH đậm đặc, hịa tan ở t0 = 70 – 800C bằng cách để nĩng trên nồi cách thủy, làm nguội và cho thêm nước cất vừa đủ 1000ml. Cho thêm vài giọt toluolen lên bề mặt và bảo quản lạnh, ở chổ tối ( 1ml chứa 25mg).
- Dung dịch Vitamin B2 mẫu (pha khi dùng): - Dung dịch vitamin B2 tiêu chuẩn 100ml - Nước cất vừa đủ 250ml - 1ml chứa 1mg Vitamin B2.
c. Tiến hành thử: Tiến hành thử trong phịng tối. Cân một lượng chất thử đã nghiền nát, lượng này cần tính tốn sao cho cĩ từ 15 đến 100 mg vitamin B2 trong 250ml dịch chiết. Cho vào bình cầu dung tích 300ml với 150ml HCl 0,1N để ở nhiệt độ 1210C trong 30 phút hoặc hấp dưới áp suất 1kg/cm2 trong 30 phút, làm lạnh xuống 450C và thêm dung dịch CH3COON 3,7N cho đến pH = 4,5 – 5,4 ( cần khoảng 5 - 6 ml dung dịch natriaxetat). Sau khi cho thêm 2 gam men ủ 30 phút ở 450C làm nguội xuống 200C và thêm nước cất đến 250ml. Lọc và bỏ đi 10ml dịch lọc đầu.
Lấy 100ml dịch lọc, lắc với 150ml clorofoc để loại huỳnh quang tạp, ly tâm cho đến khi thành 2 lớp rõ rệt. Bỏ lớp clorofoc cĩ chứa tất cả các huỳnh quang tạp, lấy lớp nước cho vào sáu cĩc đáy dẹp bằng ( làm song song để đối chiếu kết quả ) lần lượt lấy như sau:
(1)
Cốc 1 Cốc 2(1) Cốc 3(1) Cốc 4(1) Cốc 5(1) Cốc 6(1)
Dịch chiết (ml) 10 10 10 10 0 0
Vitamin B2 mẫu 2 2 0 0 0 0
Nước cất (ml) 0 0 2 2 12 12
Lắc trộn đều cho thêm nhanh
NaOH 2N (ml) 2 2 2 2 2 2
Cho chạy ngay tức khắc phản ứng quang học
Phản ứng quang học chuyển hĩa Riboflavin thành lumiflavin phải tiến hành ở 200C ( cần thiết phải điều chỉnh nhiệt độ bằng cách cho thêm đá lạnh hoặc bằng dịng nước chảy liên tục ) dưới ngọn đèn 500W cĩ lá chắn trắng phản chiếu, khoảng cách từ nền đáy cốc là 30cm, thời gian từ 30 – 45 phút.
Sau phản ứng quang học cho vào mỗi cốc : 2ml axit axetic để axit hĩa.
0,3ml KMnO4 3% để oxy hĩa trong 1 phút. 0,3ml H2O2 1,7% để loại lượng KMnO4 thừa.
Chuyển dung dịch trong mỗi cốc vào 1 ống ly tâm, cĩ nút nhám, tráng mỗi cốc với 5ml nước cất và cho vào ống ly tâm tương ứng. Cho thêm vào mỗi ống 30ml clorofoc, lắc mạnh vài lần và ly tâm đến khi phân biệt thành lớp rõ rệt. Hút bỏ lớp nước một cách cẩn thận, làm khơ clorofoc bằng cách lắc với 5 – 10 gam Na2SO4 khan. Ly tâm lại và chiết lấy phần clorofoc trong đĩ lumiflavin đem đo ở huỳnh quang kế, tránh để tiếp xúc ánh sáng trực tiếp. Dùng mẫu trắng để điều chỉnh máy và với kính lọc màu sau đây:
Kính lọc chính : BG 12 – 15,2 Kính lọc phụ : BG 21 – GG II
Hàm lượng vitamin B2 tính bằng mg trong 100g thực phẩm : ( T – B ) . 50 . 100
_______________________( S – T ) . P5 ( S – T ) . P5
Trong đĩ : T chỉ số huỳnh quang tương ứng với mẫu thử ( cốc 3 và 4 ) B = Chỉ số huỳnh quang mẫu trắng ( cốc 5 và 6 )
S : Chỉ số huỳnh quang mẫu thử cĩ thêm vitamin B2 ( cốc 1 và 2 ) P5 Trọng lượng thực phẩm cân để định lượng tính bằng gam