ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM MỤC TIÊU
3.12. Định lượng Vitamin B3 hay là vitamin PP 1 Khái niệm
3.12.1. Khái niệm
Cơng thức chung : C6H5O2N hay C6H6ON2
Vitamin B3 (cịn gọi là vitamin PP hay là Niacin) là axit nicotinic và nicotinamid và một số chất cĩ tác dụng đến sức phát triển của cơ thể, cĩ ở trong thực phẩm dưới dạng tự do hoặc dưới dạng kết hợp.
3.12.2. Phương pháp hĩa học
a. Nguyên lý
Sau khi thủy phân thực phẩm ở mơi trường kiềm, chiết xuất nicotinic và nicotinamid bằng HCl tinh khiết hĩa bằng cách hấp thụ và phản hấp thụ trên sắc ký cột, loại màu bằng Pb(OH)2 lên màu vàng với thuốc thử bromua xyanogien và đo cường độ màu hình thành ở quang sắc kế.
b. Dụng cụ, vật liệu và thuốc thử
Dung dịch axit nicotinic tiêu chuẩn ( 1ml chứa 25µg ) Axit nicotinic 25mg
HCl 10ml Nước cất vừa đủ 1000ml
Hịa tan axit nicotinic vào HCl 1N và thêm nước cất vừa đủ 1000ml.
Dung dịch rồi thêm dung dịch axit nicotinic mẫu ( 1ml chứa 1mg) 10ml dung dịch axit nicotinic tiêu chuẩn và 10ml KH2PO4 20% rồi thêm nước cất vừa đủ 250ml. Dung dịch cĩ đệm photphat.
Dung dịch NaOH 1N và 0,5N Dung dịch HCl 1N 2N và 8N
Dung dịch phenolphetalein 1% trong cồn 900 Dung dịch KH2PO4 5%
Dung dịch bromua xyanogien (CNBr) Dung dịch A : KCN 10 gam
Dung dịch KH2PO4 5% vừa đủ 100ml
Dung dịch B : Bão hịa brom trong nước, xong gạn lấy nước trong ở trên.
- Dung dịch xyanuagen bromua: Nhỏ từng giọt dung dịch A vào dung dịch B, vừa nhỏ vừa lắc đủ cho đến khi mất màu.
Hoặc xyanogen pha 5 gam bromua vào nước cất và cho nước cất vừa đủ 100ml phải pha trong tủ hút để tránh hơi độc và đung nĩng để hịa tan.
- Dung dịch metol tinh khiết 10% trong HCl 1N. Nếu khơng tốt phải kết tinh lại. - Pb(NO3)2 bột ; K3PO4 bột ; H3PO4 tinh khiết.
- Giấy chỉ thị màu khoảng pH = 3,9 – 5,4
- Đất sắc ký Fullerde khơng xử lý hoặc tonsil 13 khơng xử lý. Mỗi lần dùng phải thử lại khả năng sử dụng của đất sắc ký.
c. Tiến hành thử
Cân 1 lượng chất thử cĩ chứa khoảng 30 – 300mg axit nicotinic hay nicotiamid, nghiền nhuyễn, cho vào bình cầu với 50ml NaOH 1N, đun nĩng ơe 1000C trong 1 giờ, lắc liên tục và nếu thực phẩm đặc quánh, cần phải dùng máy khuấy được mạnh, sau khi thủy phân, làm nguội xuống 200C và trung hịa với 25ml HCl 2N. Thêm 25ml HCl 8N để cho dung dịch cĩ nồng độ axit 2N. Nếu thực phẩm cĩ nhiều mở để mở lên trên mặt và sẽ loại dễ dàng khi lọc. Để yên 1 giờ ly tâm và lọc gạn lấy dịch chiết.
Tinh khiết dịch chiết : Hút 20ml dịch chiết trên cho vào ống ly tâm dung tích 50 ml, cho
thêm thân trọng 3g đất sắc ký, khuấy đều hoặc lắc mạnh ống ly tâm đã bỏ lớp nước bên trên, cho vào ống 30ml H2SO4 2N và 30ml nước cất lắc mạnh ly tâm, chắc bỏ lớp nước ở bên trên, chú ý khơng làm mất đất hấp thụ.
Phản hấp thụ bằng cách : cho vào 3 lần nữa với 10ml NaOH 0,5N khuấy kỹ, ly tâm và gạn lấy dung dịch ở trên cho vào 1 ống ly tâm khác đã chứa sẵn 2,5g Pb(NO3)2 loại màu và một giọt dung dịch phenolphetalein 1%. Để giai đoạn phản hấp thụ được thuận lợi, cần trộn vào đất sắc ký một ít mãnh hoặc một vài viên bi thủy tinh để khi lắc để dễ phá vỡ khối đất, hoặc nếu cĩ máy khuấy mạnh càng tốt.
Lắc mạnh dung dịch phản hấp thụ cho đến khi hình thành kết tủa Pb(OH)2 dung dịch mất màu hồng của chỉ màu phenolphrtalein. Ly tâm và chuyển dung dịch vitamin PP sang 1 ống ly tâm thứ 3, cho thêm K3PO4 bột cho đến khi kiềm nhẹ và dung dịch lại cĩ màu hồng nhẹ. Điều chỉnh pH đến 4,5 bằng H3PO4 và K3PO4. Ly tâm để loại chì photphat, gạn dung dịch lên trên để làm phản ứng lên màu với xyanogien bromua
Phản ứng lên màu tiến hành trong bình cầu nhỏ dung tích 20ml theo lần lượt như sau: Bình 1 Bình 2 Bình 3 Bình 4 Bình 5
Dung dịch mẫu axit Nicotinic 5ml 0 0 0 0
Dung dịch thử 0 5ml 5ml 5ml 5ml
Dung dịch CNBr 2,5ml 2,5ml 0 2,5ml 2,5ml
Dung dịch KH2PO4 0 0 2,5 0 2,5
Dung dịch metol 5 5 5 0 0
Dung dịch HCl 1N 0 0 0 5 5
Dung dịch trắng để điều chỉnh máy ( bình 6 cho bình 1; bình 7 cho bình 2 …)
Bình 6 Bình 7 Bình 8 Bình 9 Bình 10 Nước cất 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml Dung dịch CNBr 2,5 2,5 0 2,5 0 Dung dịch KH2PO4 0 0 2,5 0 2,5 Dung dịch metol 5 5 5 0 0 Dung dịch HCl 1N 0 0 0 5 5
Tùy theo bình, trước hết cho dung dịch mẫu axit nicotinic, dung dịch thử hoặc nước cất, đậy nút nhẹ và cho lên nồi cách thủy 750C. Sau 15 phút cho thêm dung dịch CNBr hoặc dung dịch KH2PO4. Giữ 5 phút ở 750C; làm nguội về 200C và cho tiếp tục dung dịch metol hoặc dung dịch HCl 1N. Lắc đều và để vào chổ tối 45 phút. Đo độ tối quang học ở sắc kế với mẫu trắng tương ứng để điều chỉnh máy, cốc so màu thủy tinh dày 3cm, bước sĩng 405nm.
Bình 1 là mẫu chuẩn, bình 6 là mẫu trắng tương ứng. Bình 2 là mẫu thử, bình 7 là mẫu trắng tương ứng.
Bình 3 là phản ứng trắng cho metol, bình 8 là mẫu trắng tương ứng. Bình 4 là phản ứng trắng cho CNBr, bình 9 là mẫu trắng tương ứng.
Bình 5 là phản ứng trắng cho dung dịch phản ứng hấp thụ, bình 10 là mẫu trắng tương ứng.
d. Tính kết quả
Độ tắc quang học cuối cùng được sữa chữa (E)
E – E2 = ( E3 + E4 ) + E5Hàm lượng vitamin PP (mg) trong 100g thực phẩm : E . 15 . 100 Hàm lượng vitamin PP (mg) trong 100g thực phẩm : E . 15 . 100 __________________ E chuẩn . P5
Trong đĩ: E2 : Độ tắc quang học của bình 2
E3 : “ “ 3 E4 : “ “ 4 E 5 : “ “ 5 E chuẩn = độ tắc quang học của bình 5
P5 = trọng lượng thực phẩm (g) cần để định lượng.