B ước 5 Giống adenovirus-VP2 được bảo quản, nuôi cấy để sản xuất virus làm vacxin theo qui trình công nghệ tế bào thường qui.
3.2.15. Phương pháp kiểm tra an toàn, vô trùng, với giống và vacxin FAd9 VP2 (L/R) và phân bố virus ở các cơ quan
Bằng phương pháp nuôi cấy tế bào trong chai đáy phẳng, tiến hành sản xuất vacxin từ giống FAd9-VP2-L và FAd9-VP2-R, thu hoạch virus sau khi phát hiện có CPE sau 72 h đạt tiêu chuẩn. Thu hoạch để kiểm tra vô trùng vi khuẩn, nấm, kiểm tra tinh khiết, kiểm tra an toàn trên gà và sinh học phân tử. Về tính tương đồng miễn dịch chúng tôi thực hiện phản ứng trung hòa trên tế bào CEL: virus cốđịnh (hàm lượng 106PFU/ml)/huyết thanh pha loãng cơ số 2
Các loại môi trường kiểm tra vô trùng vi khuẩn và nấm:
- Môi trường nước thịt LB (Luria-Bertani) hiếu dùng để nuôi cấy kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn hiếu khí;
- Môi trường nước thịt LB (Luria-Bertani) gan yếm khí có phủ lớp parafin trên bề mặt để đảm bảo yếm khí (không có ô-xy một cách hoàn toàn) dùng để nuôi cấy kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn yếm khí;
- Môi trường thạch dextrose Sabouraud cải tiến chứa kháng sinh (DIFCO Inc) thành phần gồm 20 g thạch (agar), 20 g glucose, 10 g peptone và một ít kháng sinh (ampicillin và stretomycin) dùng để nuôi cấy kiểm tra sự có mặt của nấm (fungi);
60
Kiểm tra vô trùng virus (chú trọng với virus Newcastle): Thực hiện bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA, hemagglutination test) thoe qui
trình (theo qui trình của OIE Terrestrial Manual 2010:
http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/a_summry.htm). Mục đích kiểm tra xem trong dịch nuôi tế bào gan phôi gà thu hoạch ở 72 h sau nhiễm giống gốc FAd9-VP2, có virus Newcastle bị tạp nhiễm và nhân lên trong đó hay không.
Gà kiểm tra an toàn vacxin: Gà 1 ngày tuổi mua của trại giống được Cục thú y chứng nhận an toàn dịch, nuôi cho đến khoảng 2 tuần tuổi, không được gây miễn dịch bằng vacxin Gumboro. Đến 2 tuần tuổi, chia 6 lô, mỗi lô 4 con, có bố trí đối chứng, tiến hành đưa vacxin với liều gấp 100 lần (0,3 ml cho một liều chứa 107 PFU/ml) vacxin FAd9-VP2-L và FAd9-VP2-R, cho từng lô theo đường tiêm dưới da; đường hô hấp (nhỏ mũi) và đướng tiêu hóa (cho trực tiếp vào miệng). Nuôi tiếp theo dõi 10 ngày để đánh giá an toàn về liều lượng của vacxin đối với cả 3 đường sử dụng.
Gà kiểm tra virus vacxin phân bố trong các cơ quan: Gà 1 ngày tuổi mua của trại giống được Cục thú y chứng nhận an toàn dịch, nuôi cho đến khoảng 2 tuần tuổi, không được gây miễn dịch bằng vacxin Gumboro. Đến 2 tuần tuổi, cùng với gà thử an toàn liều lượng vacxin, được bố trí thêm 1 lô (3 con) chỉđưa vacxin 1 liều/con (tương đương 105 PFU) loại FAd9-VP2-L bằng đường tiêu hóa (cho trực tiếp vào miệng). Sau 48 giờ, thu nhận gan, lách và túi Fabricius để tách DNA và kiểm tra sự có mặt của virus vacxin trong các cơ quan nói trên. Do vacxin chứa adenovirus FAd9-VP2-L có hệ gen là DNA, nên chỉ cần thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi GF-GR (đặc hiệu gen VP2 thu nhận vùng “siêu biến
đổi” độ dài 474 bp). Nếu có sản phẩm PCR (474 bp) chứng tỏ: i) adenovirus tái tổ hợp FAd9-VP2-L chứa hộp gen VP2; ii) có mặt virus vacxin tại cơ quan đang kiểm tra, nghĩa là virus đang thực hiện sự nhân lên và biểu hiện kháng nguyên.