K ết quả đánh giá nuôi cấy tế bào gan phôi gà một lớp:
4.6.4.3. Ki ểm tra virus vacxin phân bố trong các cơ quan
Sau khi đưa vacxin 1 liều/con (tương đương 105 PFU) loại FAd9-VP2-L (chúng tôi chỉ thử nghiệm với vacxin FAd9-VP2-L) bằng đường tiêu hóa (cho trực tiếp vào miệng); sau 48 giờ, thu nhận gan, lách và túi Fabricius để tách DNA làm khuôn thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi GF-GR (vùng “siêu biến
đổi” gen VP2) để kiểm tra sự có mặt của virus vacxin trong các cơ quan này. Kết quả trình bày ở Hình 4.21.
Kết quả Hình 4.21 cho thấy rõ ràng sản phẩm PCR (474 bp) thu được, ở các giếng 2, 3, 4, 5 (khuôn DNA tổng số tách từ máu, gan, lách, túi Fabricius), giống như đối chứng dương từ khuôn là DNA plasmid tách dòng pCR2.1 chứa gen VP2 và DNA của virus vacxin FAd9-VP2-L. Điều này chứng tỏ, đoạn DNA đặc hiệu vùng “siêu biến đổi” trong gen VP2 đã được thu nhận.
Chúng tôi thực hiện tách dòng trong plasmid pCR2.1 với một sản phẩm PCR (474 bp) của mẫu DNA từ lách. Sau khi giải trình tự và phân tích, kết quả cho thấy, sản phẩm PCR chính là đoạn DNA của vùng “siêu biến đổi” của gen VP2 (Hình 4.22). Như vậy, virus vacxin FAd9-VP2-L đã có mặt trong các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch sau 24 - 48 h, chủ yếu là gan lách, túi Fabricius, thậm chí trong máu của gà được đưa vacxin này vào.
103
Hình 4.21: Kết quảđiện di kiểm tra vùng “siêu biến đổi” của gen VP2 (474 bp) thu nhận từ các mẫu. Ghi chú: 1. Đối chứng (-); 2. Sản phẩm gen VP2 vùng siêu biến đổi của mẫu máu; 3. Sản phẩm gen VP2 vùng siêu biến đổi của mẫu lách; 4. Sản phẩm gen VP2 vùng siêu biến đổi của mẫu gan; 5. Sản phẩm gen VP2 vùng siêu biến đổi của mẫu túi Fabricius; 6. Sản phẩm gen VP2 vùng siêu biến đổi của mẫu virus vacxin FAd9-VP2-L; 7. Đối chứng (+): Sản phẩm gen VP2 vùng siêu biến đổi lưu giữ trong plasmid pCR2.1
Hình 4.22: Kết quả giải trình tự kiểm tra chuỗi gen vùng “siêu biến đổi” (474 bp) của gen VP2 thu nhận từ mẫu lách được tách dòng trong plasmid pCR2.1.
Kết luận
i) Giống và vacxin FAd9-VP2 (L và R) đều vô trùng tuyệt đối với các vi khuẩn hiếu khí, yếm khí và nấm.
ii) Vacxin FAd9-VP2 (L và R) có độ an toàn cao với gà đưa vacxin, khi sử dụng gấp 100 lần bằng cả 3 đường tiêm, hô hấp và uống, sau khi theo dõi 10 ngày.
Vector pCR2.1 DNA của VP2 vùng “siêu biếnđổi”
Vector pCR2.1 DNA của VP2 vùng “siêu biếnđổi”
564bp 2 kb 474bp M 1 2 3 4 5 6 7 564bp 2 kb 474bp M 1 2 3 4 5 6 7
104
iii) Virus vacxin FAd9-VP2-L sau 48 h phân bố trong các cơ quan quan trọng có thẩm quyền miễn dịch ở gà là gan, lách, túi Fabricius, có cả trong máu, sau khi kiểm tra bằng PCR thu nhận vùng “siêu biến đổi” của gen VP2, chứng tỏ virus đã được nhân lên và biểu hiện duy trì kháng nguyên VP2.
iv) Giải trình tự đoạn gen VP2 từ mẫu lách thu được, chứng minh chắc chắn sự có mặt của adenovirus vacxin tái tổ hợp FAd9-VP2-L mang hộp gen VP2 trong virus vacxin.