V Tế bào HEK
5.4.2.3. Thực hiện gây đồng nhiễm “trực tiếp“ DNA plasmid adenovirus (pAdEasy-1) khung vector và DNA plasmid con thoi tái tổ hợp trên tế bào E col
BJ5183
DNA tinh sạch của plasmid pShuttle-CMV-VP2 đã cắt mở vòng bằng
PmeI, được xử lý bằng enzyme alkaline phosphatase ở 37oC trong 30 phút. Sau
đó, DNA được điện di trên thạch agarose và đoạn DNA được “thôi” (elution) khỏi thạch bằng bộ kit tinh sạch AccuPrep™ Gel Purification Kit của hãng Bioneer (Hàn Quốc. Kết quả kiểm tra cho thấy có 1 băng DNA (8,9 kb) rất rõ (Hình 5.8). Qua tính toán, nồng độ DNA đạt khoảng 100 ng/µl.
M1 1 2 3 M 1 2 3 6,4kb 9,5kb 8,9kb M 1 2 3 M 1 2 3 6,4kb 9,5kb 8,9kb
132
Hình 5.8. Kiểm tra đoạn DNA của pShuttle-CMV-VP2 sau khi cắt mở vòng bằng enzyme PmeI. 1, 2, 3: Lần lượt DNA của các plasmid pShuttle-CMV-VP2 của các chủng GKN-T1ST; GKN-G202; và GQG-52-70.
Thực hiện các bước gây đồng nhiễm trực tiếp, như sau:
- Làm lạnh trên đá.các ống tube Eppendorf và cuvette (sử dụng cuvette có khoảng hở là 0,2 cm).
- Lấy ống tế bào E. coli BJ5183 từ tủ lạnh âm - 80oC và để tan trên đá. - Nhẹ nhàng hút 40 µl tế bào khả biến BJ5183 cho vào ống tube Eppendorf đã làm lạnh.
- Cho vào đó 1 μl (100 ng) DNA mở vòng đã xử lý bỏ gốc phosphate, của pShuttle-CMV-VP2. Gõ nhẹống tube và ủ trên đá.
- Đặt thiết bị tạo xung điện Bio-Rad Gene Pulser electroporator theo hướng dẫn: 200 Ω, 2.5 kV, 25 μF.
- Chuyển toàn bộ hỗn hợp BJ5183 + DNA con thoi + DNA adenovirus vào ống cuvette một cách nhẹ nhàng, cho hỗn hợp lắng xuống đáy ống.
- Đẩy nhẹ nhàng ống cuvette vào khay xung điện cho đến khi cuvette tiếp xúc với điện cực.
- Ấn nút điện chỉ một lần, nhanh chóng lấy cuvette ra khỏi khay và cho vào ngay lập tức 1 ml môi trường LB vô trùng đã chuẩn bị trước; trộn tế bào cho đều bằng pipette.
- Chuyển huyễn dịch tế bào sang ống Falcon.
- Ống huyễn dịch tế bào chuyển nạp được ở 37°C trong 30 phút trước khi trải đĩa.
- Trải huyễn dịch tế bào lên đĩa thạch LB-agar có kanamycin. Bố trí 3-4
đĩa được trải tế bào cùng một lúc.
133
Kết quả có nhiều khuẩn lạc toàn màu trắng kích thước to nhỏ khác nhau xuất hiện trên đĩa thạch. Chúng tôi chọn một số (10 khuẩn lạc) kích thước bé theo chỉ dẫn, để nuôi cấy trong môi trường LB có bổ sung Kanamycin, lắc qua
đêm (12 - 14 h) ở 220 vòng phút.