Hệ thống plasmid adenovirus HAd5 và plasmid contho- 123docz.net

B ước 5 Giống adenovirus-VP2 được bảo quản, nuôi cấy để sản xuất virus làm vacxin theo qui trình công nghệ tế bào thường qui.

3.1.3. Hệ thống plasmid adenovirus HAd5 và plasmid contho

Đối với hệ thống HAd5, plasmid chứa DNA của HAd5 làm khung vector và plasmid con thoi đã được thiết kế có sẵn do các hãng sinh phầm sản xuất; có qui trình hướng dẫn chu đáo, chỉ cấn tái thiết kế và sử dụng đối với đối tượng là

pF∆TR2-EGFP or pF∆TR2-EGFPinv 48133 bp Amp EGFP ORI PacI 0% PacI 100%

homologous recombination in E. coli

xxxxx xxxxxxx FAdV-9 DNA PacI 100% PacI 0% Amp SalI SalI pF∆TR2-EGFP or pF∆TR2-EGFPinv 48133 bp Amp EGFP ORI PacI 0% PacI 100% pF∆TR2-EGFP or pF∆TR2-EGFPinv 48133 bp Amp EGFP ORI PacI 0% PacI 100%

homologous recombination in E. coli

xxxxx xxxxxxx FAdV-9 DNA PacI 100% PacI 0% Amp SalI SalI PacI

FAdV-9 chỉ thị (huỳnh quang)

(Thực hiện tại Canada) Đồng nhiễm trongE. coli Hepatoma (CH-SAH) pF∆TR2-EGFP or pF∆TR2-EGFPinv 48133 bp Amp EGFP ORI PacI 0% PacI 100%

homologous recombination in E. coli

xxxxx xxxxxxx FAdV-9 DNA PacI 100% PacI 0% Amp SalI SalI PacI

FAdV-9 chỉ thị (huỳnh quang)

(Thực hiện tại Canada)

Đồng nhiễm trongE. coli

Hepatoma (CH-SAH)

“hộp gen kháng nguyên VP2“ của virus Gumboro [34,71]. Hệ thống HAd5 chúng tôi sử dụng cho đề tài là do hãng Stratagene cung cấp, tên gọi là AdEasy adenoviral vector system, (http://www.qcbio.com/stratagene/pAdEasy- 1%20Vector.htm), gồm các đơn nguyên thành phần chính sau đây:

- Plasmid adenovirus khung vector (pAdEasy-1) (Hình 3.3);

- Plasmid con thoi (pShuttle-CMV) (Hình 3.4);

- E. coli khả biến cho thực hiện gây đồng nhiễm (E. coli chủng BJ5183);

- E. coli siêu khả biến cho plasmid tái tổ hợp (E. coli chủng XL10-Gold®);

- Tế bào động vật bậc cao cho lắp ráp adenovirus tái tổ hợp (AD293, tức là

HEK293) (Hình 3.5).

i) Plasmid pAdEasy-1 làm khung vector (Hình 3.3): là DNA vòng, khép kín, chứa hệ gen của adenovirus phân type 5 (HAd-5) của người, do hãng khép kín, chứa hệ gen của adenovirus phân type 5 (HAd-5) của người, do hãng Stratagene thiết kế, trong đó “gen độc” E1 và E3 đã bị cắt bỏ, trở nên là adenovirus nhược độc thiểu năng không có khả năng tự nhân lên, có mức độ an toàn sinh học cao. Muốn tái tạo virus mới, HAd-5 nhược độc này cần được bổ sung các protein tối cần thiết là E1 và E3, mà chỉ có trong điều kiện nhiễm tương tác với tế bào HEK293 (AD-293) (Hình 3.5), virus HAd-5 mới có khả năng thực hiện được đầy đủ quá trình tái tạo. Do vậy, HEK293 là dòng tế bào khống chế sự tạo ra và dùng để sản xuất có điều kiện đối với vector adenovirus HAd-5 mang gen kháng nguyên ngoại lai (Stratagene Inc.). Plasmid pAdEasy-1 có kích thước 33,5 kb, chứa gen β-lactamase kháng kháng sinh ampicillin, đảm bảo nuôi cấy trong môi trường chứa ampicillin sau khi chuyển nạp vào E. coli. Plasmid pAdEasy-1 có khả năng tiếp nhận một đoạn DNA ngoại lai kích thước đến 7,5 kb, là một vector lý tưởng để cài hộp gen đơn gen hoặc đa gen. Plasmid pAdEasy-1 có 2 chuỗi gen đặc nhiệm: chuỗi đồng nhiễm trái (cánh tay trái) (left arm homology) và chuỗi đồng nhiễm phải (cánh tay phải) (right arm homology), bố trí ở hai đầu biên của vùng hoạt động/vùng mầm (pBR322 ori) của plasmid (Hình 3.3).

Hình 3.3. Sơ đồ cấu trúc của plasmid khung pAdEasy-1 mua của hãng Stratagene (Stratagene Inc.). (Chi tiết giải thích cấu trúc, xem trong bài).

Hình 3.4. Sơ đồ cấu trúc của plasmid con thoi pShuttle-CMV và vùng đa nối MCS tiếp nhận DNA ngoại lai (Stratagene) [70] (Chi tiết giải thích cấu trúc, xem trong bài). KpnI và NotI (đóng khung) là hai vị trí lựa chọn để gài hộp gen VP2 vào.

Hình 3.5. Tế bào HEK293. (A): Nuôi cấy thành một lớp sau 72 h (đạt >90% phủ đáy); (B): nhuộm huỳnh quang (Nguồn: http://hek293.com/); (C): Nuôi cấy mọc thành một lớp sau 48 h, do chúng tôi (Đề tài Kc04.24/06-10), thực hiện.

ii) Plasmid con thoi pShuttle-CMV của hãng Stratagene (Hình 3.4) là một vòng DNA khép kín có độ dài 7,5 kb, chứa gen kháng lại kháng sinh

kanamycin, đảm bảo nuôi cấy được trong môi trường chứa kanamycin sau khi chuyển nạp vào E. coli, có vùng hoạt động/vùng mầm ((pBR322 ori) và có vùng đa nối MCS (multiple cloning site) được cài vào sau chuỗi CMV promoter và trước chuỗi tín hiệu SV40 polyadenylation. Như vậy, hộp gen kháng nguyên VP2 cần cài vào đây, đơn giản chỉ cần hai thành phần là: Chuỗi Kozak và toàn bộ gen kháng nguyên VP2 (Kozak-VP2), với hai điểm cắt của hai enzyme giới hạn phù hợp ở hai đầu (chúng tôi chọn: KpnI và NotI) (Hình 3.4). Vùng MCS có khả năng tiếp nhận được một đoạn DNA ngoại lai có kích thước đến 6,6 kb rất thuận lợi cho việc cài gen ngoại lai vào; và như vậy, kể cả chuỗi CMV promoter ởđầu 5‘ và chuỗi tín hiệu SV40 polyadenylation ởđầu 3‘, toàn bộ hộp gen hoàn chỉnh (nếu tiếp nhận DNA ngoại lai 6,6 kb) có độ dài đến 7,5 kb. Hai chuỗi

đồng nhiễm trái (left arm region) và chuỗi đồng nhiễm phải (right arm region), phân cách bằng chuỗi nucleotide của enzyme PmeI (GTTTAAAC), là vùng DNA có thành phần nucleotide hoàn toàn đồng nhất với vùng DNA của mỗi chuỗi đồng nhiễm trái (left arm homology) và chuỗi đồng nhiễm phải (right arm homology) ở plasmid adenovirus pAdEasy-1 (của Stratagene) có vai trò hợp nhất với nhau, để trao đổi chéo thành phần DNA của hai plasmid (vector và conthoi) khi gây đồng nhiễm. Kết quả, một plasmid adenovirus tái tổ hợp mới,

A B C

chỉ chứa vùng hoạt động/vùng mầm của pShuttle-CMV (kháng kháng sinh kanamycin) và chứa toàn bộ hệ gen của HAd5 adenovirus đã được nạp “hộp gen kháng nguyên“ vào. Vùng R-ITR và L-ITR là những đoạn cấu trúc lặp ngược (short inverted terminal repeats) có chức năng quan trọng trong việc đảm bảo chu kỳ nhân lên của virus (Hình 3.4).

iii) Tế bào đặc thù HEK293 (tên gọi của hãng Stragene là AD293), là dòng tế bào thuần xuất xứ từ tế bào thận bào thai người (human embryonic kidney cell), phát triển từ dòng HEK293 thông dụng với lợi thế cải tiến tăng cường bám dính và hình thành plaque. Do hệ gen HAd5 vector (ở pAdEasy-1) bị thiếu gen E1, nên không tự tổng hợp được trong các tế bào thông thường khác, nên chỉ có HEK293/AD293 mới có khả năng tổng hợp và cung cấp protein E1 cho sự tái tạo hình thành hạt adenovirus hoàn chỉnh (Hình 3.5).

Hệ thống plasmid adenovirus HAd5 và plasmid contho

Gi ới thiệu virus gây bệnh Gumboro

Gi ới thiệu virus gây bệnh Gumboro