VIIxxxxx xxx
4.5.3. Kết quả xác định PFU của giống FAd9-VP2 (FAd9-VP2-L và FAd9-VP2-R)
FAd9-VP2-R)
Do có 2 giống virus là FAd9-VP2-L và FAd9-VP2-R, nên chúng tôi bố trí chuẩn độ cho cả hai loại. Mỗi giống được pha loãng cấp số 10, bắt đầu từ 10-5 đến 10-10, gây nhiễm hai dãy giếng tế bào (duplicate assay), mỗi giếng tế bào gây nhiễm 0,1 ml (100 ul) virus FAd9-VP2-L hoặc FAd9-VP2-R, mỗi nồng độ.
Hình 4.10. Tế bào Hepatoma nhiễm ở nồng độ virus gây nhiễm là 10-6 của FAd9-VP2-L có số lượng plaque nhiều (xem tươi, không nhuộm bằng đỏ trung tính).
Kết quả thống kê một cách khái quát mức độ hình thành plaque, ở mỗi nồng độ virus gây nhiễm, được trình bày ở Bảng 4.1. Ở các nồng độ gây nhiễm
83
10-5đến 10-7, plaque hình thành rõ, số lượng nhiều, giảm dần theo độ pha loãng. Hình 4.10 cho thấy số plaque vẫn còn nhiều ở tế bào gây nhiễm virus ở nồng độ 10-6. Giới hạn có hình thành và không hình thành plaque cho cả hai giống FAd9-VP2-L và FAd9-VP2- R, đều nằm ở giữa nồng độ 10-8 và 10-9.
Bảng 4.1. Theo dõi PFU hình thành sau khi gây nhiễm virus và phủ thạch
Virus 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 ĐC Dãy 1 ++++ ++++ ++ + - - - FAd9-VP2-L Dãy 2 ++++ ++++ ++ + +/- - - Dãy 1 ++++ ++++ ++ + - - - FAd9-VP2-R Dãy 2 +++++ ++++ ++ + +/- - -
Ghi chú: Dấu (+) biểu hiện số lượng PFU một cách khái quát. Ở 10-8, số lượng PFU là 10 đến 15 plaque; 10-9 không thấy rõ; 10-10 hoàn toàn không có plaque, giống nhưđối chứng (ĐC).
Kết quả cho thấy:
- Đối với virus FAd9-VP2-L: Dãy 1: Ở 10-8, số lượng plaque là 10; Dãy 2: Ở 10-8, số lượng plaque là 15, trung bình là 12. Ở 10-9, số lượng plaque là 0.
- Đối với virus FAd9-VP2-R: Dãy 1: Ở 10-8, số lượng plaque là 12; Dãy 2: Ở 10-8, số lượng plaque là 14; trung bình là 13. Ở 10-9, số lượng plaque là 0.
Áp dụng công thức tính toán, có kết quả như sau: # Số plaque
d x V = PFU/ml
d = nồng độ pha loãng virus
V = thể tích chứa virus gây nhiễm mỗi nồng độ
Đối với virus FAd9-VP2-L: Độ pha loãng 10-8, thể tích gây nhiễm là 0,1 ml, có số plaque trung bình là 12; PFU được tính như sau: 12 : (10-8 x 10-1) = 12: 10-9; hay PFU = 1,2 x 108 PFU/mL. Giá trị này có ý nghĩa cho biết, nếu pha loãng virus (hay vacxin từ virus này) ở nồng độ 1000 lần PFU (tức là chứa 105PFU/ml), khi gây nhiễm 1 ml vào tế bào sẽ có 100% tạo plaque; hoặc để tính liều vacxin khi sử dụng.
84
Đối với virus FAd9-VP2-R: Độ pha loãng 10-8, thể tích gây nhiễm là 0,1 ml, có số plaque trung bình là 13, PFU được tính như sau: 13 : (10-8 x 10-1) = 13 : 10-9; hay PFU = 1,3 x 108 PFU/mL.
Như vậy, hai loại adenovirus gia cầm tái tổ hợp FAd9-VP2-L và FAd9- VP2-R đều thích ứng tốt trên tế bào Hepatoma, có CPE hình thành rõ, chuẩn độ cho hiệu giá PFU cao (FAd9-VP2-L: PFU = 1,2 x 108 PFU/mL; FAd9-VP2-R: PFU = 1,3 x 108 PFU/mL). Đây là hai giống nguyên gốc FAd9-VP2, phía Canada đã bàn giao cho phía Việt Nam để tiếp truyền và sản xuất vacxin.
Ngày 05/05/2010, tại Trường Đại học Guelph, lễ ký kết chuyển giao vật tư sinh học MTA được tổ chức. Tham gia ký kết: i) Phía Trường Đại học Guelph (Canada) gồm có: TS David Hobson, Giám đốc Bộ phận chuyển giao công nghệ; GS.TSKH Nagy Eva, đối tác hợp tác của phía Canada; ii) Phía Viện Công nghệ sinh học (Việt Nam) gồm có: PGS.TS. Trương Nam Hải, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học; PGS.TS. Lê Thanh Hòa, Chủ nhiệm đề tài KC04.24/06-10, đối tác hợp tác Việt Nam (Copy văn bản cung cấp trong Hồ sơ báo cáo).
Giống virus FAd9-VP2-L và FAd9-VP2-R bàn giao là giống virus đã được đông khô để bảo quản. Trên cơ sở ký kết chuyển giao vật tư sinh học (MTA) chúng tôi tiếp nhận hai giống FAd9-VP2-L và FAd9-VP2-R và một số lượng vacxin tương đương 500 liều/mỗi loại. Giống và vacxin được tiếp tục nghiên cứu ứng dụng tại Việt Nam, trước hết là kiểm tra kiểm nghiệm giống và vacxin tiếp truyền và sản xuất trên môi trường tế bào gan phôi gà sơ cấp.