B ước 5 Giống adenovirus-VP2 được bảo quản, nuôi cấy để sản xuất virus làm vacxin theo qui trình công nghệ tế bào thường qui.
3.2.11. Phương pháp lây nhiễm (transfection) để tạo adenovirus tái tổ hợp trong tế bào đặc thù
trong tế bào đặc thù
- Đối với hệ thống FAd9 gia cầm, cần sử dụng tế bào u gan gà Hepatoma
dòng CH-SAH (Trường Đại học Guelph, Canada) hoặc LMH (ATCC, Mỹ). - Đối với hệ thống HAd5, tế bào đặc thù thích ứng là HEK293 (Stratagene Inc.).
Đối với cả hai hệ thống FAd9 và HAd5, khi lây nhiễm đều theo một qui tắc là phải sử dụng Lipofectamin (Invitrogen) và nuôi cấy vào mỗi loại tế bào tương ứng, để adenovirus tái tổ hợp được tạo thành. Adenovirus tái tổ hợp hoàn chỉnh có hệ gen tái tổ hợp chứa “hộp gen kháng nguyên VP2“, đã được lắp ráp bao gói và hình thành hạt virion một cách giống như trong tự nhiên, trong các tế bào nuôi cấy.
Đối với hệ thống FAd9, lây nhiễm plasmid FAd9-VP2, tiến hành như sau:
Bước 1. Nuôi tế bào Hepatoma dòng thuần: Tế bào gốc dòng thuần CH- SAH có nguồn gốc từ gan của gà (Hepatoma) duy trì liên tục, được lấy từ tủ lạnh âm sâu (-80oC) và giải đông trên đá. Tế bào dòng CH-SAH được nuôi trong khay có 6 giếng tròn đáy phẳng, dung tích mỗi giếng cho 1 ml môi trường
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (GIBCO Inc.), ở tủ chuyên
dụng 37oC trong điều kiện có 5% CO2, cho đến khi mọc thành một lớp, đạt 70% - 80% phủđáy (giờ thứ 48). Tế bào mọc một lớp mịn, phủđều đáy giếng.
52
Bước 2.Cắt DNA FAd9-VP2 bằng PacI: Plasmid tái tổ hợp FAd9-VP2 (gồm hai loại: pFAd9-VP2-L và pFAd9-VP2-R) được cắt bằng PacI để mở vòng.
Thành phần hỗn hợp cắt bằng enzyme PacI, như sau:
Thành phần Thể tích
Nước 12 µl
FastDigest buffer 10X 2 µl
pFAd9-VP2-L (hoặc pFAd9-VP2-R) 5 µl
PacI 1 µl
Tổng cộng 20 µl
Mô tả như sau: Lấy 5 µl mỗi loại DNA của pFAd9-VP2-L và pFAd9- VP2-R, hỗn hợp cùng với 1 µl PacI và 2 µl FastDigest buffer 10X (Fermentas) trong 12 µl nước. Hỗn hợp được ủ ở 37oC trong 10 phút cho enzyme cắt hoàn toàn.
Bước 3. Lây nhiễm vào tế bào Hepatoma: Lấy 10 ul DNA (0,4 ug/ul) của plasmid FAd9-VP2-L hoặc FAd9-VP2-R (đã cắt bằng PacI) trộn với 100 ul DMEM và cho vào đó 24 ul Lipofectin (Invitrogen), tạo thành hỗn hợp DNA/lipofectin, để khoảng 15 - 30 phút ở nhiệt độ phòng. Lấy khay nuôi tế bào
Heptoma đã mọc thành một lớp ra khỏi tủ, hút đổ bỏ môi trường bên trên, rửa lớp tế bào bằng DMEM nguyên chất (không có FBS). Cho 2,5 ml môi trường DMEM/(FBS) vào chai nuôi, ủở tủấm 37oC có CO2 trong 10 phút, rồi cho hỗn hợp DNA/lipofectin lên tế bào, nuôi trong tủ ấm 37oC có CO2 trong 4 giờ. Sau đó, bỏ môi trường cũ, cho 6 ml môi trường DMEM/PBS 10% vào các chai và ủ trong tủấm 37oC có CO2. Sau 7 - 10 ngày, virus FAd9-VP2 đã được hình thành, thu hoạch môi trường chứa virus đã được tái tổ hợp và kiểm tra.