VIIxxxxx xxx
4.4.1. Thiết kế plasmid vector FAd9 làm khung
Mục đích chương trình hợp tác giữa Viện Công nghệ sinh học (PGS.TS. Lê Thanh Hòa, chủ nhiệm đề tài) và Trường Đại học Guelph (GS.TSKH Eva Nagy) là tạo adenovirus gia cầm mang gen VP2 (của Gumboro Việt Nam) trên nền plasmid khung FAdV-9 đã được thiết kế.
Có 3 hệ thống vector FAd9, đã được Trường Đại học Guelph, Canada thiết kế thành công:
i) Hệ thống FAdV-9 tự nhiên, gồm plasmid trung gian pFAP2 và plasmid pPacFAdV9, để duy trì adenovirus gia cầm type 9 ở dạng tự nhiên (Hình 3.1);
ii) Hệ thống FAdV-9 chỉ thị huỳnh quang, gồm plasmid trung gian mang “hộp gen EGFP” (Enhanced Green Fluorecence Protein) và plasmid
pFTR2-EGFPAdV9, để duy trì adenovirus gia cầm type 9 (đã thiết kế) huỳnh quang (Hình 3.2);
iii) Hệ thống FAdV-9 tái tổ hợp gen VP2, gồm plasmid trung gian mang “hộp gen kháng nguyên VP2” (của virus Gumboro Việt Nam) là
p∆L2.4-VP2 và plasmid pFTR2-EGFPAdV9, để tạo adenovirus FAd9-VP2 tái tổ hợp làm giống sản xuất vacxin (Hình 4.8). Đây là hệ thống adenovirus gia cầm FAd9 mà chúng tôi sử dụng cho nghiên cứu tạo vacxin cho gia cầm .
Plasmid khung FAdV-9 được thiết kế như sau:
Vùng gen TR-2 đã được cắt bỏ, thay vào đó là hộp gen EGFP (Enhanced Green Fluorecence Protein) tổng hợp sản phẩm có khả năng bắt màu huỳnh quang. Plasmid này được gọi là pF∆TR2-EGFP. Đồng thời, trong hệ gen của
77
plasmid này được bố trí thêm vùng mầm ori (của pBR322) và gen kháng kháng sinh ampicillin, do đó plasmid khung có độ dài khoảng 48,1 kb (xem Hình 3.2). Trong trường hợp chưa sử dụng thao tác tái tổ hợp nạp gen kháng nguyên, plasmid này được chuyển nạp vào E. coli và thu nhận DNA lưu giữ. Trong trường hợp cần kiểm tra và duy trì hoạt động của adenovirus, DNA plasmid này được cắt bằng PacI, rồi lây nhiễm vào tế bào Hepatoma để kiểm tra sự nhân lên của virus thông qua quan sát tế bào bắt màu huỳnh quang rất rõ nét.
Tất cả các công việc thiết kế nền để tạo các loại plasmid vectorFAd9 đều do Trường Đại học Guelph (GS.TSKH Eva Nagy) thực hiện và cung cấp cho nghiên cứu của chúng tôi, trên cơ sở cùng hợp tác phát triển adenovirus FAd9 tái tổ hợp mang gen VP2 của virus Gumboro Việt Nam.