B ước 5 Giống adenovirus-VP2 được bảo quản, nuôi cấy để sản xuất virus làm vacxin theo qui trình công nghệ tế bào thường qui.
3.2.13. Phương pháp nuôi cấy tế bào gan phôi gà một lớp
Chuẩn bị trứng có phôi:
- Chọn 10 trứng gà sạch, sau khi xử lý cloramin B 0,1% được để cho khô ráo trong buồng vô trùng, rồi được ấp ở tủ ấm điều hòa 37,5oC, với độẩm 60 - 65%, kiểm tra nhiệt độ bên trong và độẩm thường xuyên.
- Khi phôi phát triển đến ngày thứ 13, soi trứng để chọn những trứng có phôi phát triển tốt để làm tế bào gan phôi gà.
57
Hình 3.6. Minh họa các bước thực hiện qui trình sản xuất tế bào gan phôi gà.
Thực hiện sản xuất tế bào gan phôi gà CEL:
Tóm tắt các bước chúng tôi đã thực hiện qui trình sản xuất tế bào gan phôi gà (cho 3 phôi gà/lần sản xuất (Hình 3.6), như sau :
1. Tiệt trùng vỏ trứng bằng cồn i-ốt 0,5% để cho khô ráo. Dùng kéo cong vô trùng cắt vòng theo buồng hơi, bỏ nắp trứng.
2. Dùng panh đầu tù gắp phôi ra khỏi trứng, cho vào đĩa Petri, sau đó mổ phôi để lộ gan phôi và thu gan phôi (chú ý cắt bỏ túi mật) cho vào cốc thủy tinh hình chữ U, rửa gan phôi bằng PBS có kháng sinh (PBS-KS) vài lần cho sạch hồng cầu (Hình 3.6).
58
3. Dùng kéo đầu tù cắt vụn gan phôi thành huyễn dịch rồi chuyển sang bình tam giác, cho 75-100 ml PBS-KS vào huyễn dịch gan phôi, để lắng tế bào và gạn hết dịch bên trên chứa hồng cầu.
4. Cho một ít PBS-KS vào để hòa tan tế bào rồi chuyển toàn bộ sang bình thủy tinh để trypsin hóa. Dùng Trypsin 0,25% rửa vài lần và gạn hết dịch rửa, rồi cho 50 ml dung môi Trypsin (đã hâm nóng ở 37oC) và cho que từ (magnetic bar) vào để chuẩn bị khuấy từ.
5. Cho toàn bộ máy khuấy từ và bình khuấy vào tủ ấm 37oC, thực hiện khuấy từđể tách tế bào gan phôi trong 15 - 20 phút.
6. Kiểm tra tế bào bằng cách lấy một dịch khuấy cho lên lam kính, nếu thấy có tế bào đơn nhưng còn nhiều cụm mô thì tiếp tục khuấy thêm 10 phút. Kiểm tra lại thấy có nhiều tế bào đơn, ít cụm mô (2 - 10 tế bào) thì thu hoạch bằng cách chuyển tất cả dịch trên sang ống ly tâm Falcon, trong đó đã cho 5 ml huyết thanh bê FBS (huyết thanh bê sẽ ngăn trypsin hóa). Ly tâm 1500 rpm/phút trong 10 phút để thu tế bào.
7. Lấy mẫu dịch kiểm tra vô trùng vi khuẩn và đổ bỏ dịch chứa trypsin, để lại cặn tế bào. Ước lượng số cặn tế bào thu được và hòa với 3 - 5 ml MEM hoặc EBSS để có tế bào dịch đặc.
8. Tiếp tục hòa tế bào với môi trường nuôi cấy DMEM có bổ sung 5 - 10% FBS, sao cho có khoảng 2,5 x 106 tế bào/ml (thường là 1 ml tế bào dịch đặc với 150 ml môi trường nuôi). Kiểm tra tế bào pha loãng bằng xanh trypan (pha tỷ lệ 1:10, nhộm xanh trypan, đếm dưới kính hiển vi). Ra chai, khoảng 6 - 7,5 ml cho chai đáy phẳng dung tích 75 cm2. Nuôi trong tủấm 37oC, có CO2.
9. Sau 24 - 48 h, tế bào gan phôi gà đã phát triển thành một lớp phủ khoảng 70 - 80% diện tích đáy chai, lúc này có thể gây nhiễm để kiểm tra adenovirus hoặc cấy giống nuôi cấy làm vacxin