V Tế bào HEK
5.2. KẾT QUẢ SẢN XUẤT LƯU GIỮ DNA PLASMID CHỨA HỆ GEN ADENOVIRUS (HAD5) VÀ PLASMID CON THO
Sản xuất lưu giữ DNA plasmid pAdEasy-1
Một trong những công việc chuẩn bị cho thiết kế lắp ráp adenovirus tái tổ
hợp là thu nhận, sản xuất và lưu giữ DNA plasmid khung adenovirus trên tế bào
E. coli thích hợp, để sau này gây đồng nhiễm với DNA plasmid con thoi.
Plasmid adenovirus khung: tên gọi là pAdEasy-1 (33,5 kb) được đặt mua của hãng Stratagene, là một đơn nguyên sản phẩm được cung cấp trong nhiều sản phẩm của hệ thống AdEasy™ Adenoviral Vector System DNA của plasmid pAdEasy-1 được cung cấp ở dạng DNA mạch vòng, tổng số 2,5 µg (100 ng/µl trong bufer TE) [70] (Bảng 5.1).
Bảng 5.1. Thành phần và số lượng được cung cấp trong bộ kit AdEasy™ Adenoviral Vector System [70]
Vector pAdEasy-1 cần được sản xuất nhân lên một lượng lớn và lưu giữ
DNA để cung cấp nguyên liệu sau này; nhân dòng được thực hiện trong tế bào
E. coli và tách chiết DNA plasmid pAdEasy-1 được thực hiện bộ bằng
Thành phầnđược cung cấp
(Bộkit AdEasy™ Adenoviral Vector System) Sốlượng Thành phầnđược cung cấp
117
AccuPrep Plasmid Extraction Kit , Bioneer, Hàn Quốc) theo các phương pháp
đã mô tả.
- Sản phẩm DNA vector pAdEasy-1 nhân dòng, được cắt kiểm tra kích thước bằng enzyme PacI (trên bản đồ enzyme giới hạn của pAdEasy-1 có 1
điểm cắt của PacI) tạo nên 1 băng DNA có độ dài 33,5 kb.
- Kết quả cho thấy xuất hiện một băng DNA rõ nét có kích thước khoảng 33,5 kb đúng như dự kiến (không trình bày ởđây).
Sản xuất và lưu giữ ADN plasmid con thoi pShuttle-CMV
Tương tự, sản xuất và lưu giữ DNA plasmid con thoi pShuttle-CMV trên tế bào E. coli thích hợp, để có DNA tham gia thiết kế gài lắp hộp gen VP2.
Plasmid con thoi: tên gọi là pShuttle-CMV, được đặt mua của hãng Stratagene, là một đơn nguyên sản phẩm được cung cấp trong nhiều sản phẩm của hệ thống AdEasy™ Adenoviral Vector System. DNA của plasmid con thoi pShuttle-CMV được cung cấp ở dạng DNA mạch vòng, tổng số 20 µg (1 µg/µl trong bufer TE) (Bảng 5.1).
- Vector pShuttle-CMV cần được sản xuất nhân lên một lượng lớn và lưu giữ DNA để cung cấp nguyên liệu cho thiết kế plasmid con thoi pShuttle-CMV tái tổ hợp sau này; nhân dòng được thực hiện trong tế bào E. coli chủng Top 10 và tách chiết DNA plasmid pShuttle-CMV được thực hiện bộ bằng AccuPrep Plasmid Extraction Kit , Bioneer, Hàn Quốc) theo các phương pháp đã mô tả. - Sản phẩm DNA plasmid pShuttle-CMV nhân dòng, được cắt kiểm tra kích thước bằng enzyme EcoRI (trên bản đồ enzyme giới hạn của pShuttle- CMV có 1 điểm cắt của EcoRI ở vị trí 3515).
- Kết quả cho thấy xuất hiện một băng DNA rõ nét có kích thước khoảng 7,5 kb đúng như dự kiến (Hình 5.2).
118
Hình 5.2. Kiểm tra trên thạch agarose 1%, DNA của plasmid vector con thoi pShuttle-CMV sau khi cắt mở vòng bằng EcoRI của các clone 1, 2, 3, đều có kích thước 7,5 kb.
5.3. THIẾT KẾ VÀ GÀI “HỘP GEN KHÁNG NGUYÊN VP2” (KOZAK-VP2) VÀO PLASMID CON THOI PSHUTTLE-CMV