VIIxxxxx xxx
4.4.3. Gây đồng nhiễm tạo adenovirus FAd9 tái tổ hợp mang gen VP
+ Công đoạn gây đồng nhiễm trong vi khuẩn E. coli (homologous recombination in E. coli) giữa DNA của plasmid con thoi đã được gài hộp gen kháng nguyên VP2 (ở đề tài KC04.24/06-10, là gen kháng nguyên VP2 của
virus Gumboro) là p∆L2.4-VP2 (Hình 4.5) và DNA plasmid adenovirus
pFAdV-9-EGFP (hay còn gọi là pF∆TR2-EGFP) (Hình 4.8). Tế bào E. coli khả biến sử dụng để gây đồng nhiễm là E. coli chủng BJ5183 (có tại Phòng thí nghiệm của GS.TSKH Eva Nagy, Trường Đại học Guelph, Ontario, Canada).
+ Trong quá trình thiết kế hệ thống FAd9 để thực hiện công nghệ adenovirus tái tổ hợp, Trường Đại học Guelph đã thực hiện cắt bỏ vùng TR2 và đưa vào đó hộp gen EGFP (có tên gọi là pFAdV-9-EGFP), mà sản phẩm của chúng cho protein bắt màu huỳnh quang, rất thuận lợi cho thao tác và kiểm soát. Khi đưa DNA plasmid p∆L2.4-VP2 (chứa hộp gen hoàn chỉnh CMV-Kozak- VP2-polyA) hỗn hợp với pFAdV-9-EGFP, phần DNA quan trọng của p∆L2.4- VP2 trong đó có DNA của hộp gen CMV-Kozak-VP2-polyA, được chuyển vào pFAdV-9-EGFP, thay thế hộp gen EGFP. Tính theo hướng của chuỗi TR2, hộp gen CMV-Kozak-VP2-polyA có thểđược định vị theo chiều xuôi (quay trái, L) hoặc theo chiều ngược (quay phải, R), định vị không gian như thế này không ảnh hưởng đến hoạt động sao chép của gen VP2, do hộp gen chứa đầy đủ các thành phần khởi động, biểu hiện gen và kết thúc gen, hoạt động như là một đơn vịđộc lập biểu hiện gen.
+ Chúng tôi tham gia kiến tạo plasmid trung gian p∆L2.4-VP2 và thu nhận DNA của pFAdV-9-EGFP, hoàn thành các bước chuẩn bị cho đồng nhiễm. Thao tác đồng nhiễm giữa DNA plasmid trung gian p∆L2.4-VP2 (đầy đủ là:
p∆L2.4-CMV-Kozak-VP2-polyA) và DNA plasmid khung FAdV-9 (pFAdV- 9-EGFP) do đối tác Trường Đại học Guelph, Canada thực hiện.
+ Sau khi phía đối tác Canada chọn lọc được virus nguyên gốc làm giống (đó là: FAd9-VP2-L và FAd9-VP2-R), chúng tôi tham gia các công đoạn sàng lọc và chuẩn độ hiệu giá PFU; sẽ trình bày tiếp theo trong Báo cáo).
80
+ Kết quả cuối cùng là đã tạo được giống gốc adenovirus tái tổ hợp mang hộp gen VP2 của virus Gumboro Việt Nam, gồm hai loại: FAd9-VP2-L và FAd9-VP2-R, nhân lên tốt trên tế bào u gan gà Hepatoma và thích ứng trên tế bào gan phôi gà sơ cấp. Giống virus đã được chuẩn độ và đông khô. Phía đối tác Canada (Trường Đại học Guelph) đã bàn giao giống nguyên gốc ở dạng đông khô cho Viện Công nghệ sinh học, thông qua ký kết bàn giao vật liệu sinh học MTA (Material Transfer Agreement).