K ết quả đánh giá nuôi cấy tế bào gan phôi gà một lớp:
4.6.2. Ki ểm tra kiểm tra khả năng nuôi cấy virus giống FAd9-VP2 trên tế bào gan phôi gà
trên tế bào gan phôi gà
Pha giống và cấy vào môi trường nuôi
Pha giống: Giống FAd9-VP2-L (FADVAC-L) và FAd9-VP2-R (FADVAC-R) tiếp nhận từ Trường Đại học Guelph, được PGS.TS Lê Thanh Hòa (Viện Công nghệ sinh học) cung cấp ở dạng tươi, nồng độ virus là 1 x 107 PFU/ml (tính toán theo hồ sơ của Trường Đại học Guelph là: 1 x 108 PFU/ml
93
trước khi đông khô; sau đông khô và hòa lỏng trở lại sẽ giảm 1 - 2 pha PFU/ml). Do vậy, chúng tôi quyết định pha loãng chỉ ở 10 lần và 100 lần để cấy virus, nhằm xác định được sự nhân lên của virus tiếp truyền trên tế bào gan phôi gà. Pha giống và bố trí cấy giống, được thực hiện theo Bảng 4.3.
Bảng 4.3. Nồng độ giống được pha và bố trí cấy giống vào tế bào gan phôi gà
TT Giống FAd9- VP2 (FAVAC) Pha loãng 10 lần (nồng độ: 1 x 105 PFU/ml) Pha loãng 100 lần (nồng độ: 1 x 104 PFU/ml) Số lượn(g (ml) cấy vào mỗi chai tế bào (dung tích 75 cm2) Số chai được cấy mỗi loại 1 FAd9-VP2-L (FAVAC-L) 10 ml 10 ml 2 ml/chai 4/đợt 2 FAd9-VP2-R (FAVAC-R) 10 ml 10 ml 2 ml/chai 4/đợt
3 Đối chứng DMEM DMEM 2 ml/chai 4/đợt
Cấy giống vào môi trường CEL một lớp: Các chai nuôi cấy tế bào CEL một lớp đến 48 h, sau khi kiểm tra có lớp tế bào đẹp, mịn, đều, phủ kín > 80% đáy chai (Hình 4.15), được chọn để cấy giống như bố trí ở Bảng 4.3.
Cấy giống như sau:
- Từ từđổ bỏ hết tất cả môi trường nuôi bên trên lớp tế bào.
- Tùy mỗi nồng độ bố trí (Bảng 4.3), hút 2 ml cho lên trên lớp tế bào (chú ý nhẹ nhàng tráng chai cho virus lan đều khắp lớp tế bào), ủ trong tủ ấm 37oC/có CO2 trong 30 phút cho virus hấp phụ vào tế bào. Đối với chai đối chứng, chỉ cho 2 ml DMEM/FBS và cho ủ tủấm như trên.
- Lấy các chai ra và cho thêm vào đó 6 – 7,5 ml DMEM/FBS ngập lớp tế bào đã hấp phụ virus, nuôi tiếp trong tủấm 37oC/có CO2.
- Kiểm tra các chai nuôi cấy để biết sự nhân lên của virus thông qua quan sát sự hủy hoại tế bào (CPE) sau 24 h, 48 h, 72 h, 96 h; 144 h, kèm với kiểm tra các chai đối chứng.
94
Chọn giống: Để chọn giống, chúng tôi xác định khả năng nhân lên của 2 loại giống tại 72 h nuôi cấy sau nhiễm. Kiểm tra các chai nuôi cấy giống virus
FAd9-VP2-L (FADVAC-L) và FAd9-VP2-R (FADVAC-R) khi cấy ở độ pha
loãng 10 lần và 100 lần giống cấp 1, tại 72 h nuôi cấy cho thấy, giống FAd9- VP2-L có CPE rõ ràng hơn và khả năng nhân lên mạnh hơn rất nhiều so với giống FAd9-VP2-R (Hình 4.16). Như vậy, chúng tôi chỉ chọn giống FAd9-VP2- L và pha loãng giống cấp 1 ở độ pha loãng 10 lần để khảo sát thời gian thu hoạch virus.
Hình 4.16. Đánh giá CPE kết quả nuôi cấy giống FAd9-VP2-L (FADVAC-L) và FAd9-VP2-R (FADVAC-R) trên tế bào gan phôi gà sau 72 h để chọn giống.
Ghi chú: Ký hiệu giống và tế bào ở góc trên, số 10 nói lên độ pha loãng từ giống gốc để cấy vào tế bào gan phôi gà.
Xác định thời gian thu hoạch giống virus: Để xác định thời gian thu hoạch thích hợp nhất, chúng tôi pha giống FAd9-VP2-L ở độ pha loãng 10 lần, nuôi cấy trên tế bào gan phôi gà một lớp, kiểm tra CPE ở 48 h, 72 h, 96 h và 144 h; có bố trí đối chứng tại từng thời điểm kiểm tra. Kết quảđược trình bày ở Hình 4.17. Kết quả cho thấy, tại thời điểm 48 h, tuy có CPE nhưng ở mức độ rất thấp; tại 72 h, CPE biểu hiện rõ có đến trên 80% tế bào nhiễm virus; tại 96 h, CPE tuy rõ ràng, nhưng tế bào biểu hiện bong khỏi chai, trong môi trường có thể có tạp chất; tại 144 h, tế bào bị chết nhiều bong khỏi đáy chai, nổi trong môi trường, phần nhiều có thể tế bào chết già, chết không đặc hiệu. Đối với đối chứng, cho đến 96 h, vẫn phát triển tốt; đến 144 h, cũng vẫn tồn tại và bám vào đáy chai, nhưng đã có biến đổi già, xuất hiện nhiều không bào trong tế bào (Hình 4.17).
95
Hình 4.17. Đánh giá CPE để xác định thời điểm thu hoạch virus FAd9-VP2-L