V Tế bào HEK
126BSA 10X 1 µl
Buffer 10x 1 µl KpnI 0,2 µl NotI 0,2 µl Tổng cộng 10 µl
- Hỗn hợp cắt được ủ 37oC trong 2 giờ, sau đó được điện di kiểm tra trên thạch agarose 1% trong 30 phút. Kết quả cho thấy có 2 băng DNA, một băng 7,5 kb, và băng kia khoảng 1,38 kb của hộp gen VP2.
Kiểm tra sản phẩm bằng giải trình tự:
Đại diện mỗi chủng một clone đã kiểm tra ở Hình 5.4 được giải trình tự để kiểm tra đầu 5’ và đầu 3’ của hộp gen VP2 cài vào plasmid con thoi pShuttle-CMV (gọi là pShuttle-CMV-VP2) và thu nhận toàn bộ chuỗi gen VP2. Mỗi phản ứng giải trình tựđược sử dụng mỗi mồi riêng biệt, đó là các mồi sau:
PShutF 5´GGTCTATATAAGCAGAGCTG 3´ Mxuôi ồi
Giải trình tự, bám ở
plasmid con thoi pShuttle-CMV
PShutR 5´GTGGTATGGCTGATTATGATCAG 3´ Mngồượi c
Giải trình tự, bám ở
plasmid con thoi pShuttle-CMV KpnI KOZAK VP2 pShuttle-CMV HỘP GEN VP2 NotI VP2 2 bộmã kết thúc pShuttle-CMV HỘP GEN VP2 (Chuỗi CMV-promoter) (Chuỗi tín hiệu SV40 polyA) A B pShuttle-CMV-VP2 KpnI KOZAK VP2 pShuttle-CMV HỘP GEN VP2 NotI VP2 2 bộmã kết thúc pShuttle-CMV HỘP GEN VP2 (Chuỗi CMV-promoter) (Chuỗi tín hiệu SV40 polyA) A B pShuttle-CMV-VP2
127
Hình 5.6 Trình tự nucleotide tại đầu 5’ và 3’ của chromatogram giải trình tự
một clone đại diện của plasmid con thoi pShuttle-CMV-VP2.
Giản đồ giải trình tự (chromatogram) của một số clone tái tổ hợp được trình bày đại diện ở Hình 5.6.
Kết quả kiểm tra đầu 5’ cho thấy, chuỗi nucleotide của vector plasmid con thoi tái tổ hợp pShuttle-CMV-VP2 chứa chuỗi promoter CMV, tiếp sau đó là chuỗi nucleotide điểm cắt của KpnI (GGTACC) và chuỗi Kozak (CCACCATGG). Thành phần chuỗi gen kháng nguyên VP2 bắt đầu là ATGG (có trong chuỗi Kozak) và kéo về phía đầu 3’ (Hình 5.6). Như vậy, hộp gen VP2
đã được cài vào plasmid con thoi một cách thành công, tại đầu 5’ không có sai khác gì.
Kết quả kiểm tra đầu 3’ cho thấy, tiếp theo chuỗi nucleotide của gen VP2 là bộ mã kết thúc TGA và TAA, tiếp sau đó là chuỗi nucleotide điểm cắt của
NotI (GCGGCCGC), tiếp đến là các nucleotide của vector plasmid con thoi pShuttle-CMV (Hình 5.6). Tương tự, hộp gen VP2 đã được cài vào plasmid con thoi một cách thành công, tại đầu 3’ cũng không có sai khác gì.
Chuỗi nucleotide của hộp gen VP2 (ký hiệu là syn = synthetic) của các chủng được đăng ký trong Ngân hàng gen, với các số đăng ký là: synBDG: (HQ655806); SynBDG23 (HQ655807); synG202 (HQ655808); SynGHY (HQ655809); SynGT1ST (HQ655810) và SynGTG25 (HQ655811).
Như vậy, hộp gen KOZAK-VP2 chắc chắn đã được cài vào trong pShuttle-CMV tạo nên plasmid tái tổ hợp pShuttle-CMV-VP2, sau khi tách dòng, đã được kiểm tra bằng các phương pháp khác nhau, kể cả giải trình tự và thu nhận chuỗi gen VP2, chuẩn bị cho thao tác gây đồng nhiễm.