VIIxxxxx xxx
4.3.3. Chuyển nạp và chọn lọc plasmid trung gian p∆L2.4-VP
Plasmid p∆L2.4-CMV-Kozak-VP2-polyA (gọi tắt là p∆L2.4-VP2) được chuyển nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng GT116 và tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp để kiểm tra kết quả. Sau khi có khuẩn lạc, tiến hành nuôi cấy trong môi trường LB lỏng. Tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp, sử dụng enzyme giới hạn HindIII và NotI cắt DNA plasmid tái tổ hợp để kiểm tra và chọn lọc dòng tế bào có chứa hộp gen “CMV-Kozak-VP2-polyA”. Phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp, bao gồm các thành phần như sau:
Kết quả chọn lọc các DNA plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn gen VP2 được trình bày ở Hình 4.7. Kết quả cho thấy, có các băng DNA tương ứng với plasmid p∆L2.4 (khoảng 9 kb) và “hộp gen CMV-Kozak-VP2-polyA” (khoảng 2,1 kb)) là DNA hộp gen được chèn vào tại một số clone được kiểm tra (Hình 4.7A). Trên cơ sở đó, DNA của các clone này được tiếp tục kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi CMV-up Primer và PolyA-dn Primer, bám vào hai đầu của DNA hộp gen VP2, cho thấy clone số 11 và 22 có sản phẩm PCR tương ứng với độ dài cần kiểm tra (~2,1 kb) và có thể đây là các plasmid con thoi tái tổ hợp đã tiếp nhận hộp gen VP2 (Hình 4.7B).
Hình 4.7. Kết quả sàng lọc các DNA VP2 cài vào plasmid p∆L2.4 (A) và kiểm tra các clone tái tổ hợp bằng phản ứng PCR với cặp mồi CMV-up Primer và PolyA-dn Primer (B). Ghi chú: Sản phẩm 2,1 kb của clone 11 và 22 là đúng như dựđoán. M 4 7 10 11 17 2230 B A 2,1kb M 4 7 10 11 17 2230 B A M 4 7 10 11 17 2230 M 4 7 10 11 17 2230 B A 2,1kb
76
Sau giai đoạn này, chúng tôi đã thiết kế thành công plasmid trung gian p∆L2.4-VP2 và sản xuất thu nhận được một lượng DNA của plasmid p∆L2.4- VP2 tái tổ hợp, để phục vụ cho đồng nhiễm với DNA vector FAd9 adenovirus gia cầm sau này.