B ước 5 Giống adenovirus-VP2 được bảo quản, nuôi cấy để sản xuất virus làm vacxin theo qui trình công nghệ tế bào thường qui.
3.2.7. Phương pháp thiết kế và gài “hộp gen kháng nguyên VP2” vào plasmid con tho
“Hộp gen kháng nguyên VP2” (antigenic VP2 expression cassette) là một đoạn DNA có hai đầu là chuỗi nucleotide của các điểm cắt của enzyme giới hạn
và toàn bộ gen kháng nguyên đích VP2 được cài vào. Sử dụng PCR “mỏ neo” (anchor-PCR) với cặp mồi chuyên biệt đặc hiệu để thu nhận toàn bộ sản phẩm “hộpgen kháng nguyên VP2”.
Đối với hệ thống FAd9 gia cầm: Hộp gen kháng nguyên là CMV- Kozak-VP2-PolyA. Bước 1: Sử dụng cặp mồi E1R - E1Fđể thu nhận toàn bộ gen VP2 và bổ sung thành phần của hộp gen ở đầu 5’ là chuỗi Kozak (GCCACC), để thu nhận đoạn DNA có chuỗi Kozak và gen VP2 và các enzyme giới hạn HindIII và NotI. Trình tự các chuỗi mồi như sau: E1R: 5’- ATCAAGCTTGCCACCATGACAAACCTGCAAGATC3’ (34 nucleotide) (điểm cắt của HindIII gạch bên dưới; chuỗi Kozak được đóng khung); E1F: 5’-
ACTGCGGCCGCTCACCTTATGGCCCGGATTATG-3’ (33 nucleotide)
(điểm cắt của NotI gạch bên dưới; bộ mã kết thúc được bôi đậm). Sau đó, nối vào plasmid pGEMT (Promega) để tách dòng. Bước 2: Thực hiện PCR thu nhận đoạn DNA hộp gen CMV-Kozak-VP2-PolyA với mồi xuôi CMV-up Primer và mồi ngược PolyA-dn Primer (chuỗi mồi không công bố) dùng để thu nhận toàn bộ hộp gen hoàn chỉnh CMV-Kozak-VP2-PolyA để đưa vào plasmid trung gian p∆L2.4, chuẩn bị cho công đoạn gây đồng nhiễm.
Đối với hệ thống HAd5 người: Do plasmid con thoi pShuttle-CMV đã có sẵn chuỗi nucleotide của promoter CMV, nên chúng tôi thiết kế cặp mồi thu nhận toàn bộ gen VP2 và bổ sung thành phần của hộp gen ở đầu 5’ là chuỗi Kozak (CCACCATGG), tạo hộp gen Kozak-VP2, có KpnI và NotI là hai điểm cắt ở hai đầu hộp gen. Theo yêu cầu, chúng tôi thiết kế mồi xuôi GVP2KZF có điểm cắt KpnI và chuỗi Kozak CCGCCATGG ở đầu 5’; và mồi ngược GV2R
49
có hai bộ mã kết thúc (TAATGA) trước điểm cắt NotI (GCGGCCGC) ở đầu 3’.
Cặp mồi như sau: Mồi GKPKZF:
5’CTCGGTACCCCACCATGGCAAACCTGCAAGATCAAAC3’ (phần in
nghiêng là điểm cắt của KpnI; phần đóng khung là chuỗi Kozak; phần gạch bên
dưới là gen VP2); Mồi GV2R:
5’ATAAGAATGCGGCCGCTTATCACTCAAGGTCCTCATCAGAGAC 3’
(phần in nghiêng là NotI; phần đóng khung in đậm là 2 bộ mã kết thúc TGATAA; phần gạch bên dưới là gen VP2).
Đoạn DNA sản phẩm hộp gen VP2 được nối vào pCR2.1 tách dòng, sau đó được tách ra bằng hai enzyme KpnI-NotI, để có toàn bộ hộp gen VP2, đưa vào plasmid con thoi pShuttle-CMV, chuẩn bị cho gây đồng nhiễm.