B ước 5 Giống adenovirus-VP2 được bảo quản, nuôi cấy để sản xuất virus làm vacxin theo qui trình công nghệ tế bào thường qui.
3.2.8. Phương pháp lưu giữ DNA plasmid của hệ thống HAd5 trong E col
Hệ thống HAd5 (AdEasy™ Adenoviral Vector System của hãng
Stratagene) cung cấp hai loại plasmid: DNA plasmid pShuttle-CMV (7,5 kb) và DNA plasmid pAdEasy-1 adenovirus (33,5 kb). Chúng tôi tiến hành chuyển nạp
DNA plasmid pShuttle-CMV vào E. coli chủng DH5a và DNA plasmid
pAdEasy-1 vào E. coli chủng BJ5183, sau đó chọn lọc tách chiết DNA của mỗi loại để thu nhận một lượng lớn DNA đủđể thao tác.
Phương pháp nhân dòng pAdEasy-1 mô tả vắn tắt như sau:
- Lấy 0,1µl DNA vector pAdEasy-1 pha loãng 10 lần.
- Chuyển 3 µl sản phẩm vector đã pha loãng vào ống tế bào khả biến E. coliủđá trong 45 phút.
- Chuyển tế bào vào bểổn nhiệt 42oC trong 45 giây (shock nhiệt), sau đó chuyển tế bào vào đá trong 2 phút.
- Bổ sung 100 µl môi trường SOC, nuôi tế bào trong máy lắc ổn nhiệt 200 vòng/phút trong 1 giờở 37oC.
- Chuyển 50 µl dịch nuôi cấy lên đĩa thạch LB + ampicillin và trải đều. - Ủđĩa qua đêm ở 37oC.
50
Nuôi cấy và thực hiện tách chiết DNA plasmid pAdEasy-1 bằng bộ AccuPrep Plasmid Extraction Kit (Bioneer, Hàn Quốc), như mô tảở mục 3.2.6.
Phương pháp nhân dòng pShuttle-CMV: Lấy 1 ul DNA plasmid pha loãng 10 lần, rồi lấy 1 ul chuyển nạp vào E. coli chủng DH5a, trải đĩa thạch có kanamycin, sau 24 giờ có khuẩn lạc mọc thì chọn 1 khuẩn lạc nuôi cấy trong môi trường lõng LB, bổ sung kanamycin, lắc qua đêm, rồi thực hiện tách chiết
DNA plasmid pShuttle-CMV bằng bộ AccuPrep Plasmid Extraction Kit
(Bioneer, Hàn Quốc), như mô tảở mục 3.2.6.