B ước 5 Giống adenovirus-VP2 được bảo quản, nuôi cấy để sản xuất virus làm vacxin theo qui trình công nghệ tế bào thường qui.
3.2.17. Phương pháp kiểm tra miễn dịch của vacxin bằng ELISA
Thực hiện bằng phương pháp ELISA sử dụng bộ kit của hãng IDEXX (Mỹ). Bộ sinh phẩm ELISA có tên gọi là FlockChek kit (IBD) mua từ IDEXX Laboratories Inc. (Westbrook, Maine, 04092- USA), do Viện Công nghệ sinh học cung cấp. Đánh giá thí nghiệm, thực hiện theo hướng dẫn và xử lý số liệu theo phần mềm của hãng cung cấp. Kỹ thuật ELISA áp dụng là kỹ thuật gián tiếp (indirect ELISA). Bộ FlockChek (IBD) kit của IDEXX, bao gồm:
Thành phần sinh phẩm Số lượng
1. Đĩa đã phủ kháng nguyên Gumboro (8x12 giếng) 5 đĩa
2. Đối chứng dương: Huyết thanh dương tính Gumboro (bảo quản
trong sodium azid) 1,9 ml
3. Đối chứng âm: Huyết thanh gà âm tính Gumboro (sodium azid) 1,9 ml 4. Goat anti-chicken IgG gắn horseradish peroxidase conjugate (bảo
quản với kháng sinh gentamycin)
50 ml
5. Dung dịch pha huyết thanh (trong sodium azid) 235 ml
6. Cơ chất TMB 60 ml
7. Dung dịch ngừng phản ứng 60 ml
Ghi chú: Một số dung dịch khác cần cho phản ứng nhưng không được cung cấp trong bộ kit: ví dụ, dung dịch phủđĩa, dung dịch rửa, dung dịch PBS (1x).
63
Các bước tiến hành đánh giá kết quả theo hướng dẫn của nhà sản xuất:
Bước chuẩn bị: Lập bảng ký hiệu mẫu ghi ở các giếng, bao gồm bố trí các mẫu đối chứng âm, đối chứng dương và mẫu cần phát hiện kháng thể. Lập danh sách mẫu kiểm tra.
Bước thứ nhất: Phủ kháng nguyên: Đĩa ELISA của IDEXX đã được phủ kháng nguyên Gumboro (chủng GLS) có sẵn, do hãng IDEXX (Mỹ) cung cấp.
Cho huyết thanh: Pha huyết thanh ở nồng độ 1/500 với dung dịch PBS (1x) theo chỉ dẫn, rồi cho vào các giếng: mỗi mẫu huyết thanh cho vào 2 giếng, mỗi giếng 100 ul (thực hiện song đôi để có kết quả xử lý chỉ số OD trung bình). Để riêng 4 giếng để nhỏ 100 ul huyết thanh dương chuẩn, 4 giếng để nhỏ mỗi giếng 100 ul huyết thanh âm chuẩn, 4 giếng không nhỏ huyết thanh, mà thay vào đó là 100 ul dung dịch sữa tách bơ 5%. Lắc và ủở nhiệt độ 37oC trong 1 giờ. Sau khi lắc, rửa đĩa 5 lần bằng dung dịch PBS-T, đập úp đĩa xuống tập giấy cho khô nước.
Bước thứ hai:Cho kháng kháng thể gắn enzym (enzyme-conjugate):
- Kháng kháng thể gắn enzym (enzyme-conjugate) do hãng IDEXX cung cấp, được pha loãng ở nồng độ thích hợp theo chỉ dẫn với dung dịch PBS (1x) theo chỉ dẫn, rồi nhỏ vào toàn bộ các giếng, mỗi giếng 100 ul, ủ lắc ở nhiệt độ 37oC trong 1 giờ. Sau khi ủ lắc, rửa đĩa 5 lần bằng PBS-T, đập úp đĩa xuống tập giấy ELISA cho khô nước.
Bước thứ ba: Cho cơ chất (substrate): Cơ chất (substrate) là dung dịch TMB do hãng IDEXX cung cấp, được pha loãng ở nồng độ thích hợp với dung dịch PBS (1x) theo chỉ dẫn, rồi nhỏ vào các giếng, mỗi giếng 100 ul, ủ trong buồng tối 15 - 30 phút sau đó bỏ ra xem, nếu thấy lên màu thì dừng phản ứng bằng dung dịch dừng phản ứng H2SO4. Nếu lên màu kém, thì để thêm 5 - 10 phút phút nữa rồi mới dừng phản ứng.
Bước thứ tư: Dừng phản ứng và đọc kết quả: Sau khi thấy lên màu thì dừng phản ứng bằng cách nhỏ thêm vào mỗi giếng 50 ul dung dịch dừng phản ứng H2SO4. Đĩa phản ứng ELISA được đọc trên máy đọc ELISA (máy Elx800-
64
Universal Microplate Reader của hãng Bio-tec Instrument Inc.), ở bước sóng 450 nm. Kết quả là chỉ số OD (optic density) của mức độđậm đặc của màu sắc.
Tính toán: Kết quả (gọi là S/P) được tính toán dựa trên thương số của chỉ số hấp phụ màu sắc của mẫu (so với đối chứng âm) với chỉ số hấp phụ màu sắc của đối chứng dương (so với đối chứng âm). Công thức tính toán: Tỷ lệ : S/P =
Giá trị OD trung bình của mẫu - Giá trị OD trung bình của mẫu âm chuẩn Giá trị OD trung bình của mẫu dương chuẩn - Giá trị OD trung bình mẫu
âm chuẩn
65
Phần thứ tư